本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)與植株再生，具體涉及一種誘導(dǎo)四合木干細(xì)胞形成再生植株的方法。

背景技術(shù)：

1、植物生物技術(shù)涉及運(yùn)用生物學(xué)、農(nóng)學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的原理和技術(shù)，對(duì)植物進(jìn)行遺傳改良、繁殖控制、新品種培育、病蟲害防治等研究與應(yīng)用。植物組織培養(yǎng)技術(shù)逐步走向成熟。如今，植物生物技術(shù)更加注重生態(tài)環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展，其已在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝、醫(yī)藥、食品等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)大量繁殖名貴花卉以及珍稀瀕危植物的保護(hù)。四合木(tetraena?mongolica)主要分布在鄂爾多斯杭錦旗與鄂托克旗，以及烏海市、阿拉善左旗東部、賀蘭山北部及石嘴山市，因其珍稀性與獨(dú)特性，在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)獨(dú)特而關(guān)鍵的地位。它不僅對(duì)維護(hù)生態(tài)平衡至關(guān)重要，還能通過(guò)固定沙土、減少風(fēng)蝕和水土流失，對(duì)防風(fēng)固沙、改善土壤結(jié)構(gòu)起到顯著作用。四合木種群瀕危的主要原因有繁殖能力弱，干旱和鹽堿的地理因素使種子發(fā)育和萌發(fā)常受到抑制，只有1％的種子能夠成熟繁殖，其有性繁殖能力減弱；四合木易受紅緣天牛、老鼠等害蟲侵害；四合木枝條富含油脂，被稱為“油柴”，因易燃而被長(zhǎng)期作為薪柴使用，從而導(dǎo)致了大量的砍伐破壞，使得四合木的種群數(shù)量已經(jīng)減少了大約其種群孤立和生境破碎化，生態(tài)適應(yīng)性和生境適宜性下降，導(dǎo)致遺傳多樣性逐步喪失。特別是人為因素，導(dǎo)致四合木種群銳減70％，其棲息地面積也縮減了超過(guò)30％，生境退化的嚴(yán)重程度令人擔(dān)憂。現(xiàn)有技術(shù)也有借助扦插技術(shù)與愈傷組織誘導(dǎo)植株再生的方法。然而，在扦插過(guò)程中，四合木的成活率受培養(yǎng)條件的制約，普遍偏低，難以高效獲取大量種苗。而直接采用四合木愈傷組織雖可誘導(dǎo)植株再生，但其穩(wěn)定性欠佳，難以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地保持遺傳信息及親本性狀的完整性，且細(xì)胞體系難以長(zhǎng)期維持，凍存后復(fù)蘇率也較低，這些因素都限制了其在大規(guī)模獲取四合木種苗以修復(fù)荒漠化生態(tài)環(huán)境方面的應(yīng)用，因此需要提供一種新的四合木植株再生的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)四合木干細(xì)胞形成再生植株的方法，通過(guò)利用四合木干細(xì)胞作為關(guān)鍵資源，通過(guò)四合木干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)得到愈傷組織，在將得到的愈傷組織在再生因子ref1的作用下，有效提高了胚性愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)率，成功培育出再生植株，實(shí)現(xiàn)了四合木的快速繁殖。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下。

3、一種誘導(dǎo)四合木干細(xì)胞形成再生植株的方法，包括以下步驟：

4、將四合木外植體在第一誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得形成層干細(xì)胞；降形成層干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定生長(zhǎng)的四合木干細(xì)胞，將四合木干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)后，經(jīng)含愈傷培養(yǎng)基誘導(dǎo)獲得愈傷組織；

5、將愈傷組織接入含有再生因子ref1的第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)再生因子ref1促進(jìn)胚性愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化率，分化得到胚性愈傷組織；

6、將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有再生因子ref1的第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)再生因子ref1促進(jìn)胚狀體的分化，獲得四合木的胚狀體，將胚狀體接種到芽增殖培養(yǎng)基中，獲得四合木叢芽，將四合木叢芽接種到伸長(zhǎng)生根培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，獲取四合木苗，即四合木再生植株；

7、所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和所述織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，再生因子ref1的濃度均為100nm～200nm。

8、本發(fā)明通過(guò)利用四合木干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)得到愈傷組織，將獲得的愈傷組織經(jīng)過(guò)含有100nm～200nm的再生因子ref1的第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提高愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化率，大幅度提高愈傷組織的再生能力，再通過(guò)含有100nm～200nm的再生因子ref1的第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)促進(jìn)胚的分化，提高胚狀體的分化速度與成功率，減少胚狀體在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)畸形的概率，進(jìn)而有效提高了愈傷組織的再生能力，實(shí)現(xiàn)了四合木的快速繁殖。

9、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有30g/l～40g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3g/l～4g/l結(jié)冷膠、0.5mg/l～1mg/l?6-芐基氨基嘌呤和0.25mg/l～1mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸的ms培養(yǎng)基；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

10、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，光照培養(yǎng)8h/d～12h/d。

11、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述繼代培養(yǎng)基為含有30g/l～40g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3g/l～4g/l結(jié)冷膠、0.1mg/l～1mg/l?6-芐基氨基嘌呤和0.1mg/l～2mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸的ms培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

12、所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，光照培養(yǎng)8h/d～12h/d。

13、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述懸浮培養(yǎng)的具體過(guò)程如下：

14、每升懸浮培養(yǎng)基中接種50g～100g的四合木干細(xì)胞，在光照下連續(xù)培養(yǎng)15d～20d；

15、所述懸浮培養(yǎng)基為含有10g/l～30g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3g/l～4g/l結(jié)冷膠、0.1mg/l～3mg/l?6-芐基氨基嘌呤和0.25mg/l～1mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸的ms培養(yǎng)基，所述懸浮培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

16、所述懸浮培養(yǎng)的條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，持續(xù)光照15d～20d。

17、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述愈傷培養(yǎng)基為含有10g/l～30g/l蔗糖、500mg/l～600mg/l水解乳蛋白、3g/l～4g/l結(jié)冷膠、0.8mg/l～1mg/l?6-芐基氨基嘌呤、0.5mg/l～1mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸的ms培養(yǎng)基，所述愈傷培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

18、所述愈傷培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，光照培養(yǎng)10h/d～12h/d。

19、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有30g/l～40g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3g/l～4g/l結(jié)冷膠的ms培養(yǎng)基，所述第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

20、所述第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：溫度25℃～30℃，濕度60℃～80％，光照培養(yǎng)10h/d～12h/d。

21、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有30g/l～40g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3g/l～4g/l結(jié)冷膠、0.1mg/l～0.5mg/l?6-芐基氨基嘌呤和0.25mg/l～0.3mg/l?2，4-二氯苯氧乙酸的ms培養(yǎng)基，所述第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

22、所述第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，光照培養(yǎng)10h/d～12h/d。

23、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述芽增殖培養(yǎng)基為含有30g/l～40g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3.6g/l～4.0g/l結(jié)冷膠、0.1mg/l～1mg/l萘乙酸的b5培養(yǎng)基，所述芽增殖培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

24、所述芽增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，光照培養(yǎng)8h/d～12h/d。

25、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述生根培養(yǎng)基為含有30g/l～40g/l蔗糖、500mg/l～700mg/l水解乳蛋白、3.6g/l～4g/l結(jié)冷膠、0.1mg/l～1mg/l?6-芐基氨基嘌呤、1mg/l～2mg/l萘乙酸、1g/l～1.5g/l活性炭的b5培養(yǎng)基，所述生根培養(yǎng)基的ph值為5.75～5.85；

26、所述生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：溫度25℃～30℃，濕度60％～80％，光照培養(yǎng)10h/d～12h/d。

27、在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述四合木外植體具體獲得過(guò)程如下：

28、將四合木枝條切成5cm～8cm的小段，滅菌后，切成厚度為2mm～4mm的切片，得到所述四合木外植體；

29、所述滅菌的具體過(guò)程如下：水沖洗0.5h～2h，然后依次用10wt％的雙氧水浸泡1min～2min，75wt％乙醇溶液浸泡1min～2min，無(wú)菌水沖洗2次～3次，0.05wt％的氯化汞溶液浸泡10min～20min，無(wú)菌水浸泡1min～3min，再用無(wú)菌水沖洗5次～6次。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

31、本發(fā)明通過(guò)從四合木的枝條中獲取四合木的干細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)形成愈傷組織，再逐步發(fā)展為胚性愈傷組織、胚狀體、叢芽，最終實(shí)現(xiàn)再生植株的全過(guò)程。通過(guò)在第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基和第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加100nm～200nm的再生因子ref1，提高了胚性愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)率，極大提高愈傷組織的再生能力，從而有效避免了現(xiàn)有技術(shù)利用愈傷組織誘導(dǎo)植株過(guò)程中，穩(wěn)定性差、細(xì)胞體系難以長(zhǎng)期維持的問題，為構(gòu)建一個(gè)高效且遺傳穩(wěn)定的體細(xì)胞胚再生系統(tǒng)提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)于四合木的種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳穩(wěn)定性維護(hù)以及生物技術(shù)工具的開發(fā)具有深遠(yuǎn)的意義。本發(fā)明中的方法，具有生長(zhǎng)同步、遺傳信息穩(wěn)定、次生代謝產(chǎn)物生物合成穩(wěn)定及產(chǎn)量高等特點(diǎn)，很好的克服了脫分化細(xì)胞培養(yǎng)體系存在的容易遺傳變異而導(dǎo)致其生理生化特征發(fā)生改變的缺陷。

32、本發(fā)明建立了四合木葉片外植體來(lái)源的植物干細(xì)胞、愈傷組織及不定根高效誘導(dǎo)及長(zhǎng)期穩(wěn)定的離體培養(yǎng)方法，植物干細(xì)胞、愈傷組織及不定根體系均適于懸浮培養(yǎng)，干細(xì)胞呈分散的單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)存在；愈傷組織呈大細(xì)胞團(tuán)塊生長(zhǎng)；不定根保持根狀器官形態(tài)生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四合木干細(xì)胞、愈傷組織的生長(zhǎng)率分別為1080％、815％，四合木干細(xì)胞的生長(zhǎng)率最好，愈傷組織次之，故四合木干細(xì)胞更適用于生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明對(duì)四合木葉片外植體進(jìn)行多次滅菌可有效的降低染菌，顯著提高了誘導(dǎo)成功率。