本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種膽固醇羥化酶ch25h干預(yù)多肽在制備骨質(zhì)疏松癥和骨溶解癥治療產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、衰老是一個(gè)復(fù)雜、多階段、漸進(jìn)的過(guò)程，發(fā)生在生命的整個(gè)過(guò)程。衰老的主要特點(diǎn)之一是全身慢性炎癥，并伴有細(xì)胞衰老、免疫衰老、器官功能障礙和各種年齡相關(guān)疾病[1]。隨著年齡增加，與衰老相關(guān)的疾病，尤其是骨骼退行性疾病如骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，op)和骨溶解(osteolysis，ol)的發(fā)病率不斷增加。在高齡人群或絕經(jīng)后婦女骨骼系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞(osteoclast，oc)功能亢進(jìn)，當(dāng)oc介導(dǎo)的骨吸收超過(guò)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成時(shí)，骨代謝失衡導(dǎo)致op[2-3]。此外，人工植入的假體周?chē)p顆粒誘導(dǎo)oc增殖分化引起ol，oc過(guò)度增殖分化與功能亢進(jìn)是導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的主要原因[4]。目前，慢性炎癥已被認(rèn)為是衰老的內(nèi)源性因素，而oc的活化受到多種炎癥因子調(diào)節(jié)，針對(duì)oc分化與功能調(diào)控的基礎(chǔ)研究，尤其是負(fù)向調(diào)控信號(hào)通路的研究及藥物作用靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)，可為有效防治衰老相關(guān)疾病op和ol提供新靶點(diǎn)和新策略。

2、oc生成的過(guò)程受到各種細(xì)胞及炎癥因子如rankl(receptor?activator?ofnuclear?factor-κb?ligand，核因子κb受體激活因子配體)、tnf-α(tumor?necrosisfactor-α，腫瘤壞死因子α)和il-1(interleukin-1，白細(xì)胞介素-1)的調(diào)節(jié)，上述因子均能夠誘導(dǎo)nf-κb(nuclear?factor-κb，核因子κb)活化，nf-κb對(duì)于生理和病理?xiàng)l件下的oc形成和存活至關(guān)重要[5]。nf-κb在oc生理學(xué)中的核心作用主要包括rankl、rank和traf6，其中traf6已被證明通過(guò)iκb激酶(ikk)激活轉(zhuǎn)錄因子nf-κb，并通過(guò)mapk(mitogen-activatedprotein?kinase，絲裂原活化蛋白激酶)、erk((extracellular?signal-regulatedkinase，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)、jnk(c-jun?nh2-terminal?kinase，c-jun氨基末端激酶)來(lái)激活ap-1(activator?protein-1，激活蛋白-1)[6]。此外，traf6-c末端缺失與截短rank(receptor?activator?for?nuclear?factor-κ，核因子κb受體活化因子)受體保留了其刺激jnk活性而非nf-κb活性的能力，表明rank與traf6的相互作用是nf-κb活化所必需的[7]。traf6在維持正常骨結(jié)構(gòu)中的重要性已在traf6敲除小鼠中得到證實(shí)，該小鼠顯示出nf-κb信號(hào)傳導(dǎo)缺陷，因此發(fā)生骨硬化癥[8]。研究表明traf6可作為泛素連接酶的功能阻斷k63多聚泛素鏈合成，從而阻止traf6激活ikk[9]。因此，通過(guò)靶向traf6從而有效抑制nf-κb介導(dǎo)的炎癥是治療衰老與炎癥相關(guān)的骨骼退行性相關(guān)疾病的潛在途徑。

3、膽固醇-25-羥化酶(cholesterol?25-hydroxylase，ch25h)涉及膽固醇的生物合成途徑和細(xì)胞膜特性，并在調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)、炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮多重作用[10]。ch25h在抗病毒免疫中也發(fā)揮重要作用，可在病毒進(jìn)入過(guò)程中限制病毒與細(xì)胞膜的融合，并廣泛抑制vsv(vesicular?stomatitis?virus，水泡性口炎病毒)、hiv-1(human?immunodeficiencyvirus?type?1，人類(lèi)免疫缺陷病毒1型)、zikv(zika?virus，寨卡病毒)、mers-cov(middleeast?respiratory?syndrome?coronavirus，中東呼吸綜合征冠狀病毒)和sars-cov-2(severe?acute?respiratory?syndrome?coronavirus?2，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2)等病毒感染[11]。ch25h在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的作用日趨體現(xiàn)，ch25h通過(guò)膽固醇代謝重編程調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，ch25h作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)在腫瘤治療中具有巨大潛力[12]。此外，相關(guān)研究表明在軟骨細(xì)胞中膽固醇代謝的ch25h-cyp7b1-rorα軸(膽固醇25-羥化酶-細(xì)胞色素p450?7b1-視黃醇相關(guān)孤兒受體α軸)參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎，ch25h在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但ch25h能否通過(guò)酶活非依賴(lài)的方式調(diào)控oc分化和功能及分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探索[13]。

4、對(duì)于衰老與慢性炎癥導(dǎo)致oc過(guò)度活化引起的op、ol等疾病還缺乏安全有效的治療藥物，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)靶向衰老及慢性炎癥防治op和ol的新途徑和新藥物。目前，針對(duì)治療o(wú)p及ol的藥物研發(fā)已取得突破性進(jìn)展，然而在安全性與有效性方面仍面臨挑戰(zhàn)。比如部分患者在中斷使用地諾單抗后，會(huì)遭遇骨量顯著下降及反彈性椎體骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的問(wèn)題。另一方面，唑來(lái)膦酸的應(yīng)用有一定療效，但會(huì)誘發(fā)部分患者出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)。至于假體植入后的失敗與翻修情況，主要?dú)w因于假體的松動(dòng)、穩(wěn)定性不足及磨損等因素，影響假體的使用壽命，還會(huì)加劇ol進(jìn)程及骨量丟失。鑒于此，深入探究op及ol的生理病理機(jī)制，尋找更優(yōu)的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提升患者治療效果及生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)的臨床意義

5、ch25h在病毒感染、炎癥性疾病、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病中作為影響疾病進(jìn)程的關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平的變化可以通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。比如專(zhuān)利文獻(xiàn)1中涉及了在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，ch25h能夠抑制sars-cov-2的感染，且安全性較好。比如專(zhuān)利文獻(xiàn)2中涉及了通過(guò)共表達(dá)ch25h增強(qiáng)car-t細(xì)胞抗腫瘤活性的方法，提供了包含car和ch25h的修飾的免疫細(xì)胞或其前體(例如，t細(xì)胞)。ch25h在相關(guān)疾病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，但是并未涉及ch25h通過(guò)酶活非依賴(lài)的方式調(diào)控oc分化從而參與op、ol等疾病中的作用機(jī)制及應(yīng)用。同時(shí)，以ch25h為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)干預(yù)多肽尚無(wú)報(bào)道。

6、引用文獻(xiàn)：

7、非專(zhuān)利文獻(xiàn)：

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9、[2]teitelbaum?sl.bone?resorption?by?osteoclasts.science.2000sep?1；289(5484):1504-1508.

10、[3]walker?md,shane?e.postmenopausal?osteoporosis.n?engl?j?med.2023nov

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17、[8]li?s,shu?b,zhang?y,li?j,guo?j,wang?y,ren?f,xiao?g,chang?z,chend.carboxyl?terminus?of?hsp70-interacting?protein?regulation?of?osteoclastformation?in?mice?through?promotion?of?tumor?necrosis?factor?receptor-associated?factor?6protein?degradation.arthritis?rheumatol.2014jul；66(7):1854-1863.

18、[9]zhang?y,zhu?z,cao?y,xiong?z,duan?y,lin?j,zhang?x,jiang?m,liu?y,manw,jia?t,feng?j,chen?y,li?c,guo?b,sun?d.rnd3?suppresses?endothelial?cellpyroptosis?in?atherosclerosis?through?regulation?of?ubiquitination?oftraf6.clin?transl?med.2023sep；13(9):e1406.

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21、[12]xiao?j,wang?s,chen?l,ding?x,dang?y,han?m,zheng?y,shen?h,wu?s,wangm,yang?d,li?n,dong?c,hu?m,su?c,li?w,hui?l,ye?y,tang?h,wei?b,wang?h.25-hydroxycholesterol?regulates?lysosome?amp?kinase?activation?and?metabolicreprogramming?to?educate?immunosuppressive?macrophages.immunity.2024may?14；57(5):1087-1104.

22、[13]choi?ws,lee?g,song?wh,koh?jt,yang?j,kwak?js,kim?he,kim?sk,son?yo,nam?h,jin?i,park?zy,kim?j,park?iy,hong?ji,kim?ha,chun?ch,ryu?jh,chun?js.thech25h-cyp7b1-rorαaxis?of?cholesterol?metabolism?regulatesosteoarthritis.nature.2019feb；566(7743):254-258.

23、專(zhuān)利文獻(xiàn)：

24、專(zhuān)利文獻(xiàn)1：《膽固醇-25-羥化酶及其酶促產(chǎn)物在制備抑制新型冠狀病毒的藥物中的用途》，公開(kāi)號(hào)cn113018421b；

25、專(zhuān)利文獻(xiàn)2：《methods?for?enhancing?the?anti-tumor?activity?of?car?tcells?by?co-expression?of?ch25h》，公開(kāi)號(hào)wo2024036167a3。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的問(wèn)題

2、本技術(shù)屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于提供一種防治oc過(guò)度活化所致骨破壞疾病的新途徑，即以ch25h作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)干預(yù)多肽(含有16aa的traf6多肽片段)，與traf6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ch25h，從而破壞ch25h對(duì)traf6的穩(wěn)定作用，達(dá)到防治op和ol的效果。所述oc是執(zhí)行骨吸收的主要功能細(xì)胞，在骨發(fā)育、生長(zhǎng)、修復(fù)與重建中具有重要作用。oc過(guò)度活化，骨吸收功能增強(qiáng)，會(huì)引起op、ol等疾病。具體而言，本技術(shù)涉及ch25h干預(yù)多肽在op、ol中的防治效果、作用機(jī)制、實(shí)施方法和用途。

3、用于解決問(wèn)題的方案

4、本發(fā)明研究了ch25h缺失在oc分化和op、ol等疾病中的作用機(jī)理及應(yīng)用。首先，比較年輕與老齡小鼠組織中ch25h的表達(dá)情況及op病人ch25h的表達(dá)情況，相關(guān)結(jié)果表明老齡小鼠高表達(dá)ch25h，此外geo數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)op病人ch25h表達(dá)上調(diào)。然后體外通過(guò)提取原代巨噬細(xì)胞bmms評(píng)估ch25h缺失對(duì)oc分化與功能的影響，相關(guān)結(jié)果表明ch25h缺失能夠抑制oc分化。此外在體內(nèi)通過(guò)構(gòu)建小鼠去卵巢誘導(dǎo)op模型和鈦顆粒誘導(dǎo)ol模型，觀察ch25h缺失對(duì)去卵巢誘導(dǎo)op和鈦顆粒誘導(dǎo)ol模型的治療作用，分析各項(xiàng)指標(biāo)，相關(guān)結(jié)果表明體內(nèi)ch25h缺失能夠緩解去卵巢誘導(dǎo)op模型和鈦顆粒誘導(dǎo)ol模型的骨丟失癥狀。接下來(lái)進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制探索，初步探討ch25h缺失通過(guò)酶活非依賴(lài)方式減少ch25h-traf6軸介導(dǎo)的炎癥從而抑制oc分化。在保證ch25h干預(yù)多肽的安全性前提下，與traf6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ch25h，減少ch25h對(duì)traf6的穩(wěn)定作用，加速traf6降解，從而抑制oc分化與功能，這證明靶向ch25h的干預(yù)多肽有預(yù)防和/或治療o(wú)p以及ol等疾病的潛力。

5、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

6、[1].干預(yù)多肽在制備預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥的產(chǎn)品中的用途，其特征在于，所述干預(yù)多肽包含競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ch25h蛋白的位點(diǎn)；

7、所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ch25h蛋白的位點(diǎn)如seq?id?no.1的第430～432位所示；

8、所述干預(yù)多肽包含不少于15個(gè)氨基酸殘基。

9、[2].根據(jù)[1]所述的用途，其中，所述干預(yù)多肽包含不少于16個(gè)氨基酸殘基；

10、任選地，所述干預(yù)多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第415-450位中至少16個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基；

11、可選地，所述干預(yù)多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第420-435位的氨基酸殘基；

12、可選地，所述干預(yù)多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第425-440位的氨基酸殘基；

13、可選地，所述干預(yù)多肽包含如seq?id?no.1所示序列的第430-445位的氨基酸殘基。

14、[3].根據(jù)[1]或[2]所述的用途，其中，所述破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥包括骨質(zhì)疏松癥、骨溶解癥、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、惡性骨腫瘤和/或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；

15、優(yōu)選地，所述破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥包括骨質(zhì)疏松癥和/或骨溶解癥。

16、[4].根據(jù)[1]所述的用途，其中，所述破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥所述預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥包括以下(i)～(vi)中至少一項(xiàng)：

17、(i)抑制機(jī)體中破骨細(xì)胞過(guò)度分化；

18、(ii)降低機(jī)體中破骨細(xì)胞的骨吸收和骨侵蝕；

19、(iii)提升機(jī)體中骨體積分?jǐn)?shù)；

20、(iv)提升機(jī)體中骨小梁數(shù)目和厚度；

21、(v)降低機(jī)體中骨小梁分離度、孔隙率和孔隙數(shù)目；

22、(vi)提升機(jī)體中骨密度；

23、所述機(jī)體為罹患破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥的可能性的個(gè)體；

24、可選地，所述個(gè)體包括哺乳動(dòng)物；

25、可選地，所述哺乳動(dòng)物包括小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、貓、狗、馬、兔、豬、猴和人。

26、[5].根據(jù)[1]-[4]中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥的產(chǎn)品包括藥物和藥物組合物；

27、可選地，所述藥物組合物還包含一種或多種臨床上治療骨破壞疾病的藥物和/或一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。

28、[6].根據(jù)[1]-[5]中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、矯味劑、矯嗅劑、著色劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑和防腐劑中的一種或兩種以上的組合。

29、[7].靶向ch25h的抑制劑在制備預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥的產(chǎn)品中的用途，其特征在于，所述靶向ch25h的抑制劑選自降低ch25h轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)水平功能的物質(zhì)；

30、所述靶向ch25h的抑制劑包括核酸、包含核酸的載體、多肽、表達(dá)多肽的載體、核糖核蛋白復(fù)合體和小分子抑制劑中的至少一種；

31、任選地，所述多肽包括人工鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶中的至少一種；

32、任選地，所述核酸包括反義rna分子、rna干擾分子和rna適配體中的至少一種；

33、任選地，所述核糖核蛋白復(fù)合體包括crispr-cas系統(tǒng)。

34、[8].根據(jù)[7]所述的用途，其中，所述破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥包括骨質(zhì)疏松癥、骨溶解癥、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、惡性骨腫瘤和/或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

35、[9].根據(jù)權(quán)利要求[7]或[8]所述的用途，其中，所述破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥包括骨質(zhì)疏松癥和/或骨溶解癥。

36、[10].根據(jù)[7]-[9]中任一項(xiàng)所述的用途，其中，所述破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥所述預(yù)防和/或治療破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥包括以下(i)～(vi)中至少一項(xiàng)：

37、(i)抑制機(jī)體中破骨細(xì)胞過(guò)度分化；

38、(ii)降低機(jī)體中破骨細(xì)胞的骨吸收和骨侵蝕；

39、(iii)提升機(jī)體中骨體積分?jǐn)?shù)；

40、(iv)提升機(jī)體中骨小梁數(shù)目和厚度；

41、(v)降低機(jī)體中骨小梁分離度、孔隙率和孔隙數(shù)目；

42、(vi)提升機(jī)體中骨密度；

43、可選地，所述機(jī)體為罹患破骨細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)病癥的可能性的個(gè)體；

44、可選地，所述個(gè)體包括哺乳動(dòng)物；

45、可選地，所述哺乳動(dòng)物包括小鼠、大鼠、豚鼠、牛、羊、貓、狗、馬、兔、豬、猴和人。

46、發(fā)明的效果

47、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ch25h缺失能有效抑制oc分化與功能。

48、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ch25h缺失能有效緩解op和ol癥狀。

49、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ch25h通過(guò)酶活非依賴(lài)方式與tarf6結(jié)合能夠促進(jìn)oc分化。

50、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ch25h干預(yù)多肽能有效抑制oc分化。