本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物的重組菌及其構(gòu)建方法和應用，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
3-羥基丙酸(3-hydroxypropionate,3-hp)是美國能源部公布的未來全球最具開發(fā)潛力的12種高附加值生物基化工產(chǎn)品之一，具有廣闊的應用前景和很高的經(jīng)濟價值。以3-羥基丙酸為原料，可以生產(chǎn)多種具有商業(yè)價值的化合物，如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸、丙內(nèi)酯等。此外，它還可以通過聚合生成聚3-羥基丙酸。
聚3-羥基丙酸(p3hp)是一種新型生物可降解性塑料，具有優(yōu)異的生物材料性質(zhì)和機械性能，比如具有高機械強度和拉伸強度(>400mpa)、高斷裂伸長量(>300％)、生物降解性、生物兼容性、不溶于水、無毒、壓電性、熱塑性等。相對于其它兩種研究較多的可生物降解塑料聚3-羥基丁酸(phb)和聚乳酸(pla)來說，p3hp具有更優(yōu)越的性能：它比pla具有更好的穩(wěn)定性不會水解，又由于碳鏈骨架中沒有甲基而比phb更易被微生物降解。作為新型功能材料，p3hp可廣泛應用于地膜、矯形外科、個人衛(wèi)生用品、藥物控釋、包裝等領域。但是，p3hp在性質(zhì)上還存在一定缺陷，如熔點只有76℃，在一定程度上限制了工業(yè)化應用。
現(xiàn)有技術中，中國專利cn102174542b中在制備3-羥基丙酸均聚物或共聚物時，需要加入昂貴的1,3-丙二醇或1,4-丁二醇等這些結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)來合成聚合物的單體，會大大增加生產(chǎn)成本。中國專利cn104046659b中，通過加入3-羥基戊酸單體合成3-羥基丙酸的共聚物，使原有物質(zhì)的熔點得到提高，但是所使用的的代謝途徑比較復雜，引入了比較多的外源基因，加重了代謝負擔。
技術實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術中使用昂貴前體物質(zhì)增加了生產(chǎn)成本、代謝途徑過于復雜加重代謝負擔等問題，本發(fā)明首先提供了一種生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物的重組菌，所使用的代謝途徑更為簡單，可以利用簡單的廉價碳源作為發(fā)酵底物。
所述重組菌是以大腸桿菌為出發(fā)菌株，導入甘油脫水酶基因dhab123、甘油脫水酶激活因子基因gdrab、丙醛脫氫酶的基因pdup、丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因pct和聚羥基脂肪酸合成酶的基因phac，得到重組菌。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述編碼甘油脫水酶的基因dhab123的三個亞基在ncbi的基因id分別為dhab1-7947197、dhab2-7947198、dhab3-7947200，編碼甘油脫水酶激活因子的基因gdrab的兩個亞基在ncbi的基因id為gdra-6936977、gdrb-6938011，編碼丙醛脫氫酶的基因pdup在ncbi的基因id為4716036，丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶pct在ncbi的基因編號為11185364，編碼聚羥基脂肪酸合成酶的基因phac在ncbi的基因id為1041855。
本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述重組菌的方法，包括以下步驟：
1)克隆甘油脫水酶基因dhab123，將所得基因與質(zhì)粒pacycduet-1進行酶切、連接，并轉(zhuǎn)入e.colidh5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，獲得重組載體pacycduet-dhab123；
2)克隆甘油脫水酶激活因子的基因gdrab，將所得基因與步驟1)所得載體pacycduet-dhab123進行酶切、連接，并轉(zhuǎn)入e.colidh5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，獲得重組載體pacycduet-dhab123-gdrab；
3)克隆丙醛脫氫酶的基因pdup，將所得基因與步驟2)所得載體pacycduet-dhab123-gdrab進行酶切、連接，并轉(zhuǎn)入e.colidh5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，獲得重組載體pacycduet-dhab123-gdrab-pdup；
4)克隆丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶的基因pct，將所得基因與質(zhì)粒petduet進行酶切、連接，并轉(zhuǎn)入e.colidh5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，獲得重組載體petduet-pct；
5)克隆聚羥基脂肪酸合成酶的基因phac，將所得基因與步驟4)所得petduet-pct進行酶切、連接，并轉(zhuǎn)入e.colidh5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，獲得重組載體petduet-pct-phac；
6)將步驟3)與步驟5)所獲得的重組載體，轉(zhuǎn)化到宿主escherichiacolijm109(de3)感受態(tài)細胞中，獲得大腸桿菌重組菌。
所述甘油脫水酶基因dhab123在ncbi的基因id分別為dhab1-7947197、dhab2-7947198、dhab3-7947200，甘油脫水酶激活因子基因gdrab在ncbi的基因id為gdra-6936977、gdrb-6938011，丙醛脫氫酶基因pdup在ncbi的基因id為4716036，丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因pct在ncbi的基因編號為11185364，編碼聚羥基脂肪酸合成酶的基因phac在ncbi的基因id為1041855。
本發(fā)明還提供一種應用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物的方法，步驟如下：
1)在lb培養(yǎng)基中活化重組菌，培養(yǎng)10h獲得種子液；
2)將步驟1)所得的種子液，與含有氨芐青霉素與氯霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，按照體積比種子液：發(fā)酵培養(yǎng)基＝(1～2):(100～130)的比例接種后，35℃～37℃，180～220rpm條件下培養(yǎng)至od600在0.6～0.8，獲得培養(yǎng)液；
3)向所得的培養(yǎng)液中加入誘導劑異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.01～0.1mm，然后轉(zhuǎn)入30～33℃，180～220rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時。
優(yōu)選的，步驟4)所述分離提純的具體操作為：
發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體，15000rpm離心10min，水洗兩遍，無水乙醇洗一遍。將菌體放置于凍干機中凍干，干燥后的菌體通過索氏提取儀利用60℃的氯仿進行萃取，萃取6h后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟2)所述培養(yǎng)條件為：37℃，180rpm。
在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為甘油，氮源為無機氮源，如氯化銨或硫酸銨等，其他成分為無機鹽。
在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：20g/l甘油，1.5g/l三水合磷酸氫二鉀，3g/l硫酸銨，1.9g/l氯化鉀，1.09g/l一水合檸檬酸，1.14g/l二水合檸檬酸鈉，0.138g/l七水合硫酸亞鐵，0.24g/l硫酸鎂，0.1％(v/v)微量元素。
在本發(fā)明的一種實施方式中，微量元素母液的配方為：6.0g/l七水合硫酸亞鐵，2.0g/l硼酸，2.0g/l四水合氯化錳，0.8g/l四水合鉬酸銨，0.2g/l五水合硫酸銅。
在本發(fā)明的一種實施方式中，將重組菌活化后，按1％的接種量接種到含100μg·ml-1氨芐青霉素和100μg·ml-1氯霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)，待od600達到0.6時，溫度調(diào)節(jié)至30℃，并加入0.05mmiptg進行誘導，每隔12h用氨水調(diào)節(jié)ph至7，初次誘導后48h終止發(fā)酵。
本發(fā)明所獲得的的有益效果如下：
為了解決現(xiàn)有技術需要加入昂貴的前體物質(zhì)作為原料導致生產(chǎn)成本偏高、代謝途徑復雜加重代謝負擔、3-羥基丙酸均聚物熔點偏低等問題，本發(fā)明以escherichiacolijm109(de3)為宿主菌株，通過過表達關鍵合成酶基因，構(gòu)建獲得工程菌，以廉價甘油為碳源，在較短的代謝路徑下，實現(xiàn)了3-羥基丙酸共聚物(聚3-羥基丙酸-co-乳酸，p(3hp-co-lac))的首次合成。本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌具有利用甘油為唯一碳源合成3-羥基丙酸共聚物的特點，發(fā)酵48h，可以得到1.6g/l的p(3hp-co-lac)，比較3-羥基丙酸均聚物，熔點提高了39℃。
定義和縮寫
在本文中使用下列的縮寫或簡稱：
甘油脫水酶基因：dhab123
甘油脫水酶激活因子基因：gdrab
丙醛脫氫酶基因：pdup
丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因：pct
聚羥基脂肪酸合成酶基因：phac
大腸桿菌(escherichiacoli):e.coli
肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)：k.pneumoniae
沙門氏菌(salmonellatyphimurium)：s.typhimurium
埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)：m.elsdenii
惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)：p.putida
聚3-羥基丙酸：p3hp
聚3-羥基丙酸-co-乳酸：p(3hp-co-lac)
“過量表達”或“過表達”指特定的基因在生物體中大量表達，表達量超過正常水平(即，野生型表達水平)，可以通過增強內(nèi)源表達或引入外源基因來實現(xiàn)。
具體實施方式
下面通過實例來進一步闡明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于以下實施例。
下述實施例中所使用的實驗方法若無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所使用的材料、試劑等若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
所用酶試劑購自mbifermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒和回收dna片段所用的試劑盒購自美國omega公司，相應的操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行；所有培養(yǎng)基如無特別說明均用去離子水配制。
培養(yǎng)基配方：
1)種子液搖瓶培養(yǎng)基
lb培養(yǎng)基：5g/l酵母粉，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，其余為水，121℃，20min滅菌。
2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基
基本改良培養(yǎng)基：20g/l甘油，1.5g/l三水合磷酸氫二鉀，3g/l硫酸銨，1.9g/l氯化鉀，1.09g/l一水合檸檬酸，1.14g/l二水合檸檬酸鈉，0.138g/l七水合硫酸亞鐵，0.24g/l硫酸鎂，0.1％(v/v)微量元素。
微量元素母液的配方：6.0g/l七水合硫酸亞鐵，2.0g/l硼酸，2.0g/l四水合氯化錳，0.8g/l四水合鉬酸銨，0.2g/l五水合硫酸銅。
在實際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，如100mg/l的氨芐青霉素和100μg·ml-1氯霉素。
實施例1合成3-羥基丙酸共聚物的重組菌構(gòu)建
1)-3)載體pacycduet-dhab123-gdrab-pdup的構(gòu)建
1)獲取來源于k.pneumoniae的甘油脫水酶基因dhab123(三個亞基在ncbi的基因id分別為dhab1-7947197、dhab2-7947198、dhab3-7947200)，是以k.pneumoniae基因組為模板，通過pcr擴增獲得(引物：5'-cgccatatgaaaagatcaaaacgatttg-3'和5'-cacggtaccgcttagcttcctttacgcag-3')，具體擴增程序如下：
pcr結(jié)束后，進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，再利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收大小為2700bp左右的目的片段。
將獲得的dhab123基因片段和質(zhì)粒pacycduet-1用ndei和kpni在37℃水浴鍋中酶切3.5h，酶切產(chǎn)物進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，再利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收酶切產(chǎn)物。將載體與mcr基因片段按照摩爾比1:5的比例，16℃連接6h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氯霉素的lb固體平板上，pcr(同擴增程序)篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pacycduet-dhab123后，再通過限制性酶酶切和測序(華大基因)鑒定，確認已將基因正確插入載體中。
2)獲取來源于k.pneumoniae的甘油脫水酶激活因子的基因gdrab(兩個亞基在ncbi的基因id為gdra-6936977、gdrb-6938011)，是以k.pneumoniae基因組為模板，通過pcr擴增分別獲得gdra和gdrb(gdra擴增引物：5'-gagaattcgtgagcggaggtcagcatgc-3'和5'-cagaagcttcagtttctctcacttaacg-3'；gdrb擴增引物：5'-cagctttggtcagtgggagatctaaaacgaggggaccgtcatgtc-3'和5'-ttagatctcccactgaccaaagctg-3')，擴增程序如下：
pcr結(jié)束后，進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收片段gdra和gdrb。再以gdra和gdrb為模板，通過搭橋pcr擴增獲得gdrab(引物：5'-gagaattcgtgagcggaggtcagcatgc-3'和5'-ttagatctcccactgaccaaagctg-3')。擴增程序如下
pcr結(jié)束后，進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收片段gdrab基因片段，將獲得的gdrab基因片段和質(zhì)粒pacycduet-dhab123用ecori和hindiii在37℃條件下酶切3.5h，回收酶切產(chǎn)物，再進行連接，載體與gdrab基因片段按照摩爾比1:5的比例，16℃連接6h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氯霉素的lb固體平板上，pcr篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pacycduet-dhab123-gdrab后，再通過限制性酶(ecori和hindiii)酶切和測序(華大基因)鑒定，確認基因片段已經(jīng)正確插入到載體中。
3)獲取來源于s.typhimurium的丙醛脫氫酶的基因pdup(在ncbi的基因id為4716036)，是以s.typhimurium的基因組為模板，通過pcr擴增獲得(引物：5'-caggatccgatgaatacttctgaactcg-3'和5'-cagaatccttacgctttagctttaacg-3')，擴增程序如下
pcr結(jié)束后，進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，再利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收大小為1500bp左右的目的片段。
將獲得的pdup基因片段和質(zhì)粒pacycduet-dhab123-gdrab用bamhi和ecori在37℃水浴鍋中酶切3.5h，利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收酶切產(chǎn)物。將回收的載體與pdup基因片段按照摩爾比1:5的比例，16℃連接6h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氯霉素的lb固體平板上，pcr篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pacycduet-dhab123-gdrab-pdup后，再通過限制性酶(bamhi和ecori)酶切和測序(華大基因)鑒定，確認基因片段已經(jīng)正確插入到載體中。
4)-5)載體petduet-pct-phac的構(gòu)建
4)獲取來源于m.elsdenii的丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶基因pct(丙酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶pct在ncbi的基因編號為11185364)，是以m.elsdenii基因組為模板，通過pcr擴增獲得(引物：5'-ccatatgatgcgtaaagttgaaatcatc-3'和5'-ccctcgagttattttttcagacccatcggac-3')，擴增程序如下
pcr結(jié)束后，進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，再利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收大小為1600bp左右的目的片段。
將獲得的pct基因片段和質(zhì)粒petduet用ndei和xhoi在37℃水浴鍋中酶切3.5h，利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收酶切產(chǎn)物。將回收后的載體與pct基因片段按照摩爾比1:5的比例，16℃連接6h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氨芐青霉素的lb固體平板上，pcr篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒petduet-pct后，再通過限制性酶(ndei和xhoi)酶切和測序鑒定，確認基因片段已經(jīng)正確插入到載體中。
5)獲取來源于p.putida的聚羥基脂肪酸合成酶的基因phac(在ncbi的基因id為1041855)，是以p.putida基因組為模板，通過pcr擴增獲得(引物：5'-cgggatccgatgagtaacaagaacaacgatg-3'和5'-acggagctctcaacgctcgtgaacgtaggtg-3')，擴增程序如下
pcr結(jié)束后，進行1％(wt/v)瓊脂糖凝膠電泳，再利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收大小1800bp左右的目的片段。
將獲得的phac基因片段和質(zhì)粒petduet-pct用bamhi和saci在37℃水浴鍋中酶切3.5h，利用回收試劑盒(omegagelextractionkit)回收酶切產(chǎn)物。將回收得到的載體與phac基因片段按照摩爾比1:5的比例，16℃連接6h以上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氨芐青霉素的lb固體平板上，pcr篩選陽性克隆。從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒petduet-pct-phac后，再通過限制性酶(bamhi和saci)酶切和測序鑒定，確認基因片段已經(jīng)正確插入到載體中。
6)將pacycduet-dhab123-gdrab-pdup和petduet-pct-phac導入e.colijm109(de3)合成p(3hp-co-lac)
將步驟3)獲得的載體pacycduet-dhab123-gdrab-pdup與步驟5)獲得的載體petduet-pct-phac導入e.colijm109(de3)感受態(tài)細胞，涂布在含有100μg·ml-1氨芐青霉素和100μg·ml-1氯霉素的lb固體平板；涂布后的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至長出單克隆。
實施例2發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物
將實施例1獲得的工程菌株單克隆在lb培養(yǎng)基中進行活化，培養(yǎng)10h獲得種子液，種子液按種子液：基本改良液體培養(yǎng)基體積比1:100的體積比例接種到含有100ml的基本改良液體培養(yǎng)基的500ml擋板搖瓶中(內(nèi)含100μg·ml-1氨芐青霉素和100μg·ml-1氯霉素)，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。od600達到0.6左右時，溫度調(diào)節(jié)至30℃，并加入0.05mmiptg進行誘導。每隔12h用氨水調(diào)節(jié)ph至7左右，初次誘導后48h終止發(fā)酵。
發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體，15000rpm離心10min，水洗兩遍，無水乙醇洗一遍。將菌體放置于凍干機中凍干，干燥后的菌體通過索氏提取儀利用60℃的氯仿進行萃取，萃取6h后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得產(chǎn)品。將得到的產(chǎn)品通過核磁共振(avanceiii600,bruker,switzerland)對其進行定性分析，核磁圖譜證實確實獲得了產(chǎn)物p(3hp-co-lac)，產(chǎn)量1.6g/l。
利用差示掃描量熱儀(diamonddsc)對產(chǎn)物的熔點進行檢測，所得p(3hp-co-lac)的熔點為115℃，比原有材料p3hp的熔點提高了39℃。
實施例3發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物
將實施例1獲得的工程菌株單克隆在lb培養(yǎng)基中進行活化，培養(yǎng)10h獲得種子液，種子液按種子液：基本改良液體培養(yǎng)基體積比2:100的體積比例接種到含有100ml的基本改良液體培養(yǎng)基的500ml擋板搖瓶中(內(nèi)含100μg·ml-1氨芐青霉素和100μg·ml-1氯霉素)，37℃、220rpm條件下振蕩培養(yǎng)。od600達到0.8左右時，溫度調(diào)節(jié)至33℃，并加入0.1mmiptg進行誘導。每隔12h用氨水調(diào)節(jié)ph至7左右，初次誘導后24h終止發(fā)酵。
發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體，15000rpm離心10min，水洗兩遍，無水乙醇洗一遍。將菌體放置于凍干機中凍干，干燥后的菌體通過索氏提取儀利用60℃的氯仿進行萃取，萃取6h后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得產(chǎn)品。將得到的產(chǎn)品通過核磁共振(avanceiii600,bruker,switzerland)對其進行定性分析，核磁圖譜證實確實獲得了產(chǎn)物p(3hp-co-lac)，產(chǎn)量0.9g/l。
利用差示掃描量熱儀(diamonddsc)對產(chǎn)物的熔點進行檢測，所得p(3hp-co-lac)的熔點為115℃，比原有材料p3hp的熔點提高了39℃。
實施例4發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物
將實施例1獲得的工程菌株單克隆在lb培養(yǎng)基中進行活化，培養(yǎng)10h獲得種子液，種子液按種子液：基本改良液體培養(yǎng)基體積比1:130的體積比例接種到含有100ml的基本改良液體培養(yǎng)基的500ml擋板搖瓶中(內(nèi)含100μg·ml-1氨芐青霉素和100μg·ml-1氯霉素)，35℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。od600達到0.6左右時，溫度調(diào)節(jié)至30℃，并加入0.01mmiptg進行誘導。每隔12h用氨水調(diào)節(jié)ph至7左右，初次誘導后48h終止發(fā)酵。
發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體，15000rpm離心10min，水洗兩遍，無水乙醇洗一遍。將菌體放置于凍干機中凍干，干燥后的菌體通過索氏提取儀利用60℃的氯仿進行萃取，萃取6h后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，獲得產(chǎn)品。將得到的產(chǎn)品通過核磁共振(avanceiii600,bruker,switzerland)對其進行定性分析，核磁圖譜證實確實獲得了產(chǎn)物p(3hp-co-lac)，產(chǎn)量1.1g/l。
利用差示掃描量熱儀(diamonddsc)對產(chǎn)物的熔點進行檢測，所得p(3hp-co-lac)的熔點為115℃，比原有材料p3hp的熔點提高了39℃。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
sequencelisting
<110>中國科學院青島生物能源與過程研究所
<120>一種生產(chǎn)3-羥基丙酸共聚物的重組菌及其構(gòu)建方法和應用
<130>
<160>14
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>28
<212>dna
<213>引物1
<220>
<221>dna
<222>(1)..(28)
<400>1
cgccatatgaaaagatcaaaacgatttg28
<210>2
<211>29
<212>dna
<213>引物2
<220>
<221>dna
<222>(1)..(29)
<400>2
cacggtaccgcttagcttcctttacgcag29
<210>3
<211>28
<212>dna
<213>引物3
<220>
<221>dna
<222>(1)..(28)
<400>3
gagaattcgtgagcggaggtcagcatgc28
<210>4
<211>28
<212>dna
<213>引物4
<220>
<221>dna
<222>(1)..(28)
<400>4
cagaagcttcagtttctctcacttaacg28
<210>5
<211>45
<212>dna
<213>引物5
<220>
<221>dna
<222>(1)..(45)
<400>5
cagctttggtcagtgggagatctaaaacgaggggaccgtcatgtc45
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>引物6
<220>
<221>dna
<222>(1)..(25)
<400>6
ttagatctcccactgaccaaagctg25
<210>7
<211>28
<212>dna
<213>引物7
<220>
<221>dna
<222>(1)..(28)
<400>7
gagaattcgtgagcggaggtcagcatgc28
<210>8
<211>25
<212>dna
<213>引物8
<220>
<221>dna
<222>(1)..(25)
<400>8
ttagatctcccactgaccaaagctg25
<210>9
<211>28
<212>dna
<213>引物9
<220>
<221>dna
<222>(1)..(28)
<400>9
caggatccgatgaatacttctgaactcg28
<210>10
<211>27
<212>dna
<213>引物10
<220>
<221>dna
<222>(1)..(27)
<400>10
cagaatccttacgctttagctttaacg27
<210>11
<211>28
<212>dna
<213>引物11
<220>
<221>dna
<222>(1)..(28)
<400>11
ccatatgatgcgtaaagttgaaatcatc28
<210>12
<211>31
<212>dna
<213>引物12
<220>
<221>dna
<222>(1)..(31)
<400>12
ccctcgagttattttttcagacccatcggac31
<210>13
<211>31
<212>dna
<213>引物13
<220>
<221>dna
<222>(1)..(31)
<400>13
cgggatccgatgagtaacaagaacaacgatg31
<210>14
<211>31
<212>dna
<213>引物14
<220>
<221>dna
<222>(1)..(31)
<400>14
acggagctctcaacgctcgtgaacgtaggtg31