本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)代謝，具體涉及一種eets類代謝物試劑盒、檢測方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、隨著全球飲食結(jié)構(gòu)的改變，含糖飲料、甜點等高糖食品的攝入日益增加。高糖飲食（high?sugar?diet,?hsd）被證實不僅可誘導(dǎo)肥胖、2型糖尿病、胰島素抵抗等代謝性疾病，還可能對腸道結(jié)構(gòu)和功能造成持續(xù)性損害。近年的研究發(fā)現(xiàn)，高糖飲食可破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，增加致病菌豐度，促進炎癥反應(yīng)，造成腸黏膜屏障受損，進而導(dǎo)致細菌產(chǎn)物如脂多糖（lps）入血，形成“代謝性內(nèi)毒素血癥”，加劇系統(tǒng)性慢性炎癥。
2、腸道是營養(yǎng)物質(zhì)吸收和免疫調(diào)控的重要器官，其屏障功能的破壞是多種代謝病發(fā)生的關(guān)鍵早期事件。高糖飲食誘導(dǎo)腸道上皮緊密連接蛋白（如claudin-1、claudin-5）表達下降，腸道通透性增加，易引發(fā)局部乃至全身炎癥反應(yīng)。然而，目前關(guān)于高糖飲食誘導(dǎo)的腸道損傷研究，多依賴組織學(xué)觀察或細胞因子水平變化，缺乏敏感性強、可用于早期預(yù)測或動態(tài)監(jiān)測的血液分子標志物。
3、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，特別是花生四烯酸（aa）經(jīng)cyp450酶系代謝生成的環(huán)氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic?acids,?eets），在炎癥調(diào)控和血管生理中具有重要作用。在腸道炎癥和高糖誘導(dǎo)的系統(tǒng)代謝紊亂背景下，eets類代謝物是否發(fā)生變化、在高糖飲食導(dǎo)致腸損傷中的應(yīng)用，尚無明確報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種eets類代謝物試劑盒、檢測方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏檢測eets類代謝物是否發(fā)生變化、在高糖飲食導(dǎo)致腸損傷中的應(yīng)用的問題。
2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：
3、本發(fā)明目的一是提供一種eets類代謝物的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)包括14(15)-eet、11(12)-eet、8(9)-eet、14(15)-eet-d11，所述試劑盒后續(xù)利用液相色譜-質(zhì)譜檢測。
4、進一步的，通過檢測離體血漿環(huán)氧二十碳三烯酸和cyp450代謝路徑產(chǎn)物表達水平，若血漿環(huán)氧二十碳三烯酸水平顯著升高或cyp450代謝路徑產(chǎn)物表達水平顯著升高，認為存在高糖飲食導(dǎo)致腸損傷。
5、本發(fā)明目的二是提供一種檢測eets類代謝物的液相色譜-質(zhì)譜方法，包括以下步驟：
6、s1、準備標準品：標準品配置于甲醇中，校準點共10個，分別為0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、200ng/ml；
7、s2、樣品制備：先用3ml甲醇和3mlspe緩沖液預(yù)處理60mgoasisprimehlb小柱，隨后，加入2ml預(yù)冷超純水，10ul抗氧化劑、10ul內(nèi)標，200微升血漿樣本，靜置5min，開閥，使液體自然流出，然后3mlspe溶液清洗一遍，然后負壓泵抽5min,然后加入1.6ml乙酸乙酯，抽5min，真空抽空2h，然后加50微升的甲醇，冰浴超聲10min，于超濾管中14000g，10min離心得到需要檢測的樣品；
8、s3、液相色譜檢測；
9、s4、質(zhì)譜檢測。
10、進一步的，所述s2中spe緩沖液為水：甲醇：乙酸的體積比為950：49：1；所述抗氧化劑組成為?2mg/mledta、2mg/ml吲哚美辛、0.2mg/ml二丁基羥基甲苯和0.2mg/ml的按體積比水/甲醇/乙醇=2/1/1配制的三苯基膦溶液；所述內(nèi)標為濃度為125?ng/ml的14(15)-eet-d11甲醇溶液。
11、進一步的，色譜分離采用agilent?1290?ii?液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為zorbaxeclipse?plus?c18（2.1?×?150?mm，粒徑1.8?μm）。
12、進一步的，所述s3中液相色譜檢測的流動相a為含體積0.1%乙酸水溶液，流動相b為體積比840/160/1的乙腈/甲醇/乙酸；所述進樣體積為10?μl，流速為0.4?ml/min，色譜柱溫度保持在50°c，自動進樣器溫度約為20°c。
13、進一步的，所述s3中液相色譜的梯度洗脫程序如下：0-0.25分鐘，b相40%；0.25-0.5分鐘，b相從40%線性升至55%；0.5-1.2分鐘，b相從55%升至65%；1.2-4.5分鐘，b相從65%升至70%；4.5-6.7分鐘，b相從70%升至80%；6.7-7分鐘，維持80%?b相；7-7.5分鐘，b相從80%升至95%；7.5-9分鐘，維持95%?b相；9-9.3分鐘，b相從95%降至33%；9.3-12分鐘，維持33%?b相以重新平衡。
14、進一步的，所述s3中質(zhì)譜檢測在負離子電噴霧模式下進行，curtain氣體、離子源氣體1和氣體2的壓力分別為40、50和50?psi，電噴霧電壓設(shè)為-4.5?kv，離子源溫度為450°c，分析物的檢測采用多反應(yīng)監(jiān)測模式。
15、進一步的，所述s3中質(zhì)譜分析使用sciex?triple?quad??6500?plus?qtrap三重四極桿質(zhì)譜儀（framingham,?ma）；數(shù)據(jù)采集與處理采用analyst?1.7.2軟件（appliedbiosystems）。
16、本發(fā)明目的三是提供一種eets類代謝物在高糖飲食致腸損傷中的應(yīng)用，利用eets類代謝物的試劑盒和液相色譜-質(zhì)譜檢測方法得知離體血漿環(huán)氧二十碳三烯酸和cyp450代謝路徑產(chǎn)物表達水平的變化。
17、進一步的，所述eets為花生四烯酸經(jīng)cyp450酶系代謝生成的環(huán)氧二十碳三烯酸，所述eets是14(15)-eet、11(12)-eet、8(9)-eet、14(15)-eet-d11之和。
18、脂氧代謝通路產(chǎn)物8(9)-eet或eets在高糖飲食條件下在血液中顯著升高，且其水平與腸道炎癥因子及屏障功能損傷指標高度相關(guān)，通常情況下，炎癥的發(fā)生會導(dǎo)致脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的降低。
19、基于上述技術(shù)方案，本發(fā)明實施例至少可以產(chǎn)生如下技術(shù)效果：
20、脂氧代謝通路產(chǎn)物8(9)-eet或eets在高糖飲食條件下在血液中顯著升高，且其水平與腸道炎癥因子及屏障功能損傷指標高度相關(guān)，本發(fā)明利用8(9)-eet或eets作為預(yù)測高糖飲食致腸道損傷的血液標志物，通過eets類代謝物試劑盒和液相色譜-質(zhì)譜檢測方法，準確得到花生四烯酸（aa）經(jīng)cyp450酶系代謝生成的環(huán)氧二十碳三烯酸的表達水平標準；可以通過抑制高糖飲食導(dǎo)致腸損傷患者血漿中的高水平eets類代謝物，達到預(yù)防、緩解和/或改善高糖飲食導(dǎo)致腸損傷的作用。
1.一種eets類代謝物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)包括14(15)-eet、11(12)-eet、8(9)-eet、14(15)-eet-d11，所述試劑盒后續(xù)利用液相色譜-質(zhì)譜檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的eets類代謝物的試劑盒，其特征在于，通過檢測離體血漿環(huán)氧二十碳三烯酸和cyp450代謝路徑產(chǎn)物表達水平，若血漿環(huán)氧二十碳三烯酸水平顯著升高或cyp450代謝路徑產(chǎn)物表達水平顯著升高，認為存在高糖飲食導(dǎo)致腸損傷。
3.一種檢測eets類代謝物的液相色譜-質(zhì)譜方法，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測eets類代謝物的液相色譜-質(zhì)譜方法，其特征在于，所述s2中spe緩沖液為水：甲醇：乙酸的體積比為950：49：1；所述抗氧化劑組成為?2mg/mledta、2mg/ml吲哚美辛、0.2mg/ml二丁基羥基甲苯和0.2mg/ml的按體積比水/甲醇/乙醇=2/1/1配制的三苯基膦溶液；所述內(nèi)標為濃度為125?ng/ml的14(15)-eet-d11甲醇溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測eets類代謝物的液相色譜-質(zhì)譜方法，其特征在于，所述s3中液相色譜檢測的流動相a為含體積0.1%乙酸水溶液，流動相b為體積比840/160/1的乙腈/甲醇/乙酸；所述進樣體積為10?μl，流速為0.4?ml/min，色譜柱溫度保持在50°c，自動進樣器溫度約為20°c。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測eets類代謝物的液相色譜-質(zhì)譜方法，其特征在于，所述s3中液相色譜的梯度洗脫程序如下：0-0.25分鐘，b相40%；0.25-0.5分鐘，b相從40%線性升至55%；0.5-1.2分鐘，b相從55%升至65%；1.2-4.5分鐘，b相從65%升至70%；4.5-6.7分鐘，b相從70%升至80%；6.7-7分鐘，維持80%?b相；7-7.5分鐘，b相從80%升至95%；7.5-9分鐘，維持95%?b相；9-9.3分鐘，b相從95%降至33%；9.3-12分鐘，維持33%?b相以重新平衡。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測eets類代謝物的液相色譜-質(zhì)譜方法，其特征在于，所述s3中質(zhì)譜檢測在負離子電噴霧模式下進行，curtain氣體、離子源氣體1和氣體2的壓力分別為40、50和50?psi，電噴霧電壓設(shè)為-4.5?kv，離子源溫度為450°c，分析物的檢測采用多反應(yīng)監(jiān)測模式。
8.eets類代謝物在高糖飲食致腸損傷中的應(yīng)用，其特征在于，利用eets類代謝物的試劑盒和液相色譜-質(zhì)譜檢測方法得知離體血漿環(huán)氧二十碳三烯酸和cyp450代謝路徑產(chǎn)物表達水平的變化。