背景技術(shù)：

1、血紅素是幾乎所有生物體的必需分子。血紅素充當(dāng)幾種類型的蛋白質(zhì)上的輔基，包括細(xì)胞色素、過(guò)氧化氫酶、血紅蛋白和肌紅蛋白。此外，據(jù)報(bào)道，血紅素還參與哺乳動(dòng)物中的許多調(diào)節(jié)系統(tǒng)(kubota等人,j.bio.chem.,291(39):20516-20529,2016)。血紅素和血紅素前體的生成受5-氨基乙酰丙酸合酶(例如alas2)的調(diào)節(jié)。alas2被稱為5'-氨基乙酰丙酸合酶2、5-氨基乙酰丙酸合酶2或δ-氨基乙酰丙酸合酶2。抑制alas2或降低alas2蛋白水平可以減少血紅素途徑通量并抑制血紅素途徑中毒素代謝物的產(chǎn)生。血液病癥紅細(xì)胞系卟啉病是由血紅素途徑中的一種或多種酶的突變引起的。紅細(xì)胞系卟啉病的特征在于由于病理性的紅細(xì)胞卟啉升高或積累，導(dǎo)致急性光敏性并引發(fā)疼痛發(fā)作。已知紅細(xì)胞系卟啉病的至少三種亞型：x連鎖原卟啉病(xlp或xlpp)、紅細(xì)胞生成性原卟啉病(epp)、和先天性紅細(xì)胞生成性卟啉病(cep)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在某些方面，本公開(kāi)涉及一種作為x連鎖原卟啉病(xlp)的動(dòng)物模型的小鼠(小家鼠(mus?musculus))，其中所述小鼠包含在所述小鼠的至少一個(gè)5-氨基乙酰丙酸合酶2(alas2)基因座中的agtg位點(diǎn)的直接上游插入編碼seq?id?no:10的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述agtg位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于seq?id?no:9的位置1715至1718，并且所述編碼seq?id?no:10的氨基酸序列的多核苷酸在其3'末端包含終止密碼子。在一些實(shí)施例中，編碼seq?id?no:10的氨基酸序列的多核苷酸包含seq?id?no:11的核酸序列。在一些實(shí)施例中，小鼠對(duì)于插入是雜合的。在一些實(shí)施例中，小鼠對(duì)于插入是純合的。在一些實(shí)施例中，小鼠是雌性小鼠。在一些實(shí)施例中，小鼠是雄性小鼠。在一些實(shí)施例中，小鼠通過(guò)crispr/cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)(hdr)產(chǎn)生，所述hdr將插入引入到alas2基因座中。在一些實(shí)施例中，由seq?id?no:12或seq?id?no:13的核苷酸序列編碼的單向?qū)na(sgrna)用于crispr/cas9介導(dǎo)的hdr。

2、在某些方面，本公開(kāi)涉及一種作為紅細(xì)胞生成性原卟啉病(epp)的動(dòng)物模型的小鼠(小家鼠)，其中所述小鼠包含至少一個(gè)內(nèi)源性亞鐵螯合酶(fech)基因中的一個(gè)或多個(gè)基因組突變，所述一個(gè)或多個(gè)基因組突變?cè)谟伤龌蚓幋a的fech蛋白質(zhì)中產(chǎn)生相對(duì)于seqid?no:1的氨基酸序列的m98k取代。在一些實(shí)施例中，一個(gè)或多個(gè)基因組突變?yōu)橄鄬?duì)于seqid?no:2的核酸序列的t293a取代。在一些實(shí)施例中，小鼠對(duì)于產(chǎn)生m98k取代的fech基因中的一個(gè)或多個(gè)基因組突變是純合的。在一些實(shí)施例中，小鼠對(duì)于產(chǎn)生m98k取代的fech基因中的一個(gè)或多個(gè)基因組突變是雜合的。

3、在一些實(shí)施例中，小鼠包含seq?id?no:5的基因組dna序列。

4、在一些實(shí)施例中，小鼠通過(guò)crispr/cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)(hdr)產(chǎn)生，所述hdr將一個(gè)或多個(gè)基因組突變引入內(nèi)源性fech基因中。在一些實(shí)施例中，由seq?id?no:14的核苷酸序列編碼的單向?qū)na(sgrna)用于crispr/cas9介導(dǎo)的hdr。在一些實(shí)施例中，crispr/cas9介導(dǎo)的hdr利用具有seq?id?no:15的多核苷酸序列的供體dna。在一些實(shí)施例中，小鼠進(jìn)一步包含(i)至少一個(gè)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在rosa26啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下編碼反向四環(huán)素控制的反式激活子(rtta)的多核苷酸，和(ii)至少一個(gè)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含在tre啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下編碼alas2shrna序列(shalas2)的多核苷酸。

5、在一些實(shí)施例中，包含編碼rtta的多核苷酸的表達(dá)盒被插入到6號(hào)染色體中。在一些實(shí)施例中，包含編碼shalas2的多核苷酸的表達(dá)盒被插入到11號(hào)染色體中的cola1基因座處。

6、在一些實(shí)施例中，小鼠對(duì)于rtta是雜合的(rtta+/-)，并且對(duì)于shalas2是雜合的(shalas2+/-)。在一些實(shí)施例中，小鼠對(duì)于rtta是純合的(rtta+/+)，并且對(duì)于shalas2是純合的(shalas2+/+)。在一些實(shí)施例中，shalas2包含序列ugaaaaauuggucauaaccgaa(seq?idno:16)。

7、在某些方面，本公開(kāi)涉及一種作為紅細(xì)胞生成性原卟啉病(epp)的動(dòng)物模型的小鼠(小家鼠)，其中所述小鼠包含在所述小鼠的第一fech基因組基因座處插入人亞鐵螯合酶(fech)基因的內(nèi)含子3的片段，其中所述片段插入在所述小鼠fech基因的內(nèi)含子3的3'末端，使得所述小鼠fech基因保留內(nèi)含子3中的剪接供體位點(diǎn)，并且所述片段包含相對(duì)于seqid?no:3的人fech基因內(nèi)含子3核酸序列的t1658c取代，并且其中所述小鼠進(jìn)一步包含在第二fech基因組基因座處的fech基因中的功能喪失性突變。在一些實(shí)施例中，人fech基因的內(nèi)含子3的片段為156bp。在一些實(shí)施例中，人fech基因的內(nèi)含子3的片段包含seq?id?no:6的核酸序列。在一些實(shí)施例中，小鼠包含seq?id?no:8的核酸序列。在一些實(shí)施例中，小鼠通過(guò)crispr/cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)(hdr)產(chǎn)生，所述hdr將人fech基因的內(nèi)含子3的片段引入到所述小鼠的第一fech基因組基因座中。在一些實(shí)施例中，由seq?id?no:21的多核苷酸序列編碼的單向?qū)na(sgrna)和由seq?id?no:22的多核苷酸序列編碼的sgrna用于crispr/cas9介導(dǎo)的hdr。在一些實(shí)施例中，crispr/cas9介導(dǎo)的hdr利用具有seq?id?no:8的多核苷酸序列的供體dna。在一些實(shí)施例中，第二fech基因組基因座處的fech基因的功能喪失性突變?yōu)閒ech基因的基因敲除。在一些實(shí)施例中，第二fech基因組基因座處的fech基因包含提前終止密碼子。在一些實(shí)施例中，提前終止密碼子由第二fech基因組基因座處的cccgaaa缺失產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，第二fech基因組基因座處的fech基因的基因敲除通過(guò)crispr/cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)(hdr)產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，由seq?id?no:23的核苷酸序列編碼的單向?qū)na(sgrna)用于crispr/cas9介導(dǎo)的hdr。

8、在一些實(shí)施例中，小鼠與同基因野生型小鼠相比，具有降低的血紅蛋白水平。在一些實(shí)施例中，小鼠為雄性小鼠。在一些實(shí)施例中，小鼠是雌性小鼠。在一些實(shí)施例中，小鼠是c57bl/6小鼠。在一些實(shí)施例中，小鼠與同基因野生型小鼠相比，在暴露于光時(shí)展現(xiàn)出增加的皮膚病變形成。在一些實(shí)施例中，小鼠與同基因野生型小鼠相比，具有升高的血液原卟啉ix(ppix)和/或zn-ppix水平。

9、在某些方面，本公開(kāi)涉及一種永生化人cd34+血細(xì)胞，其包含編碼靶向人亞鐵螯合酶(fech)基因的shrna的外源性多核苷酸的基因組插入。在一些實(shí)施例中，編碼shrna的多核苷酸包含seq?id?no:17的核酸序列。

10、在某些方面，本公開(kāi)涉及一種永生化人cd34+血細(xì)胞，其包含編碼靶向人尿卟啉原iii合酶(uros)基因的shrna的外源性多核苷酸的基因組插入。在一些實(shí)施例中，編碼shrna的多核苷酸包含seq?id?no:18的核酸序列。

11、在一些實(shí)施例中，血細(xì)胞包含編碼c-myc的異源多核苷酸和編碼bcl-xl的異源多核苷酸。在一些實(shí)施例中，編碼c-myc的異源多核苷酸和編碼bcl-xl的異源多核苷酸與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接。在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是多西環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。