本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，尤其涉及一種過表達(dá)gpr133基因的嵌合抗原受體nk細(xì)胞、其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、癌癥的發(fā)病情況在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織(who)發(fā)布的數(shù)顯示，癌癥是全球第二大死亡原因，僅次于心腦血管病。每年新發(fā)癌癥病例約為1900萬(wàn)例，死亡病例約為1000萬(wàn)例。當(dāng)前，手術(shù)切除、放療和化療是主要的治療方式，但是這些治療方法副作用很大有時(shí)也難以完全根治，并且這些治療方式僅僅適用于前期腫瘤。盡管引入了許多小分子抑制劑和單克隆靶向藥物，但小分子抑制劑和單克隆靶向藥物在癌癥治療也存在非特異性副作用、耐藥性發(fā)展、高昂的治療成本、給藥途徑的限制以及可能的免疫反應(yīng)等不足。這些問題影響了其療效和患者的依從性，促使研究者尋找更有效的治療選擇。
2、近年來，car-t細(xì)胞治療腫瘤異軍突起，在治療惡性血液病方面取得良好成果，然而，car-t細(xì)胞治療腫瘤存在一些缺點(diǎn)。car-t細(xì)胞的制備過程復(fù)雜且耗時(shí)，患者可能面臨治療延誤。car-t治療還可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如細(xì)胞因子釋放綜合癥(crs)和神經(jīng)毒性，這些副作用需要及時(shí)監(jiān)測(cè)和管理。此外，由于car-t細(xì)胞來源于患者自身，獲取足夠的淋巴細(xì)胞可能存在困難，且細(xì)胞活性和質(zhì)量可能不均。由于car-t療法存在一些缺陷，研究人員逐漸把目光放在nk細(xì)胞上。car-nk細(xì)胞治療作為一種新興的免疫療法，具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。首先，nk細(xì)胞來源廣泛，既可以從健康供體中獲取，也可以通過誘導(dǎo)性方法生成，避免了從患者自身提取細(xì)胞的復(fù)雜性。其次，car-nk細(xì)胞具有獨(dú)特的殺傷機(jī)制，能夠快速識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，且不易引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合癥(crs)。此外，nk細(xì)胞的異體移植不會(huì)引發(fā)顯著排斥反應(yīng)，適用于更廣泛的人群。最后，car-nk細(xì)胞可以與其他治療手段聯(lián)合使用，增強(qiáng)整體療效，為癌癥患者提供了新的治療選擇。
3、nkg2d是一種重要的激活性受體，主要表達(dá)在自然殺傷(nk)細(xì)胞和某些t細(xì)胞上。它通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞和感染細(xì)胞表面表達(dá)的nkg2d配體(如mica、micb和ulbp家族分子)來介導(dǎo)免疫應(yīng)答。當(dāng)nkg2d結(jié)合其配體時(shí)，能有效激活nk細(xì)胞，促進(jìn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。此外，nkg2d的表達(dá)水平與腫瘤微環(huán)境的狀態(tài)密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞有時(shí)會(huì)通過下調(diào)nkg2d配體的表達(dá)來逃避免疫監(jiān)視。由于其在癌癥免疫治療中的潛力，nkg2d已成為研究的熱點(diǎn)，特別是在car-nk和car-t細(xì)胞療法中。
4、g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)是一類重要的膜蛋白，廣泛參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它們通過與外部信號(hào)分子(如激素、神經(jīng)遞質(zhì)和氣味分子)結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的g蛋白，從而引發(fā)一系列生物反應(yīng)。gpcr在調(diào)節(jié)多種生理過程方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括感知嗅覺、視覺、免疫反應(yīng)和神經(jīng)傳遞。gpr133作為一種孤兒受體，主要參與細(xì)胞增殖、遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。它在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用，包括免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供了一種過表達(dá)gpr133基因的嵌合抗原受體nk細(xì)胞的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
2、(1)將gpr133受體cds片段插入pll3.7載體中，獲得pll3.7-gpr133質(zhì)粒；
3、(2)將pll3.7-gpr133質(zhì)粒和pll3.7-nkg2d-car質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒pspax2和pmd2.g與適量opti-mem培養(yǎng)基混合；
4、(3)pei與適量opti-mem培養(yǎng)基混合并在室溫孵育，獲得pei-opti-mem溶液；
5、(4)將步驟(3)中的pei-opti-mem溶液加入到步驟(2)中含質(zhì)粒的opti-mem培養(yǎng)基中，室溫靜置；
6、(5)將步驟(4)中獲得的混合物加入到293t細(xì)胞中，混勻后37℃孵育；
7、(6)從細(xì)胞上清中收集病毒，分別獲得pll3.7-nkg2d-car病毒和pll3.7-gpr133病毒；
8、(7)將pll3.7-nkg2d-car病毒和pll3.7-gpr133病毒共轉(zhuǎn)染nk92細(xì)胞，獲得過表達(dá)gpr133基因的嵌合抗原受體nk細(xì)胞。
9、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(1)中g(shù)pr133受體cds片段是通過以下方法獲得的：利用序列如seq?id?no.7和8所示的引物擴(kuò)增gpr133受體完整cds序列。
10、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(1)中將gpr133受體cds片段插入pll3.7載體過程中使用了pll3.7線性化載體，所述pll3.7線性化載體是通過以下方法獲得的：利用nhei酶對(duì)pll3.7載體進(jìn)行酶切，以酶切后的載體為模板，再利用序列如seq?id?no.9和10所示的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
11、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(2)中pll3.7-gpr133質(zhì)?；騪ll3.7-nkg2d-car質(zhì)粒的使用量為4000-6000ng；包裝質(zhì)粒pspax2的使用量為4000-6000ng；包裝質(zhì)粒pmd2.g的使用量為2000-4000ng。
12、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(2)中pll3.7-gpr133質(zhì)?；騪ll3.7-nkg2d-car質(zhì)粒的使用量為5000ng；包裝質(zhì)粒pspax2的使用量為5000ng；包裝質(zhì)粒pmd2.g的使用量為3000ng。
13、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(3)中pei的用量為50ul。
14、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(4)中制得的混合物的總體積為0.8-1.2ml。
15、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(7)中pll3.7-nkg2d-car病毒和pll3.7-gpr133病毒共感染nk92細(xì)胞時(shí)的moi值都為10。
16、本發(fā)明還提供了由上述制備方法制得的過表達(dá)gpr133基因的嵌合抗原受體nk細(xì)胞。
17、本發(fā)明還提供了上述nk細(xì)胞在制備治療實(shí)體瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，本發(fā)明以nkg2d作為靶向蛋白，共受體是在腫瘤上表達(dá)的mica/b蛋白，該產(chǎn)品對(duì)所有表達(dá)mica/b的腫瘤都有治療作用，除了本發(fā)明實(shí)施例中提到的骨肉瘤外，還可以治療前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、肺癌、軟骨肉瘤、甲狀腺癌、腎癌、間皮瘤、膽管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、腦膜瘤、胰腺癌、多發(fā)性鱗狀細(xì)胞瘤、食管癌、肺小細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤等。
18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
19、本發(fā)明首次在car-nk細(xì)胞中過表達(dá)gpr133基因，顯著增強(qiáng)了car-nk細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而提高了car-nk細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。
1.一種過表達(dá)gpr133基因的嵌合抗原受體nk細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中g(shù)pr133受體cds片段是通過以下方法獲得的：利用序列如seq?id?no.7和8所示的引物擴(kuò)增gpr133受體完整cds序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中將gpr133受體cds片段插入pll3.7載體過程中使用了pll3.7線性化載體，所述pll3.7線性化載體是通過以下方法獲得的：利用nhe?i酶對(duì)pll3.7載體進(jìn)行酶切，以酶切后的載體為模板，再利用序列如seqid?no.9和10所示的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中pll3.7-gpr133質(zhì)?；騪ll3.7-nkg2d-car質(zhì)粒的使用量為4000-6000ng；包裝質(zhì)粒pspax2的使用量為4000-6000ng；包裝質(zhì)粒pmd2.g的使用量為2000-4000ng。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中pll3.7-gpr133質(zhì)?；騪ll3.7-nkg2d-car質(zhì)粒的使用量為5000ng；包裝質(zhì)粒pspax2的使用量為5000ng；包裝質(zhì)粒pmd2.g的使用量為3000ng。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中pei的用量為50ul。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中制得的混合物的總體積為0.8-1.2ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中pll3.7-nkg2d-car病毒和pll3.7-gpr133病毒共轉(zhuǎn)染nk92細(xì)胞時(shí)的moi值都為10。
9.由權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的制備方法制得的過表達(dá)gpr133基因的嵌合抗原受體nk細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9所述的nk細(xì)胞在制備治療實(shí)體瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。