本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種succ突變體及其在l-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應用。
背景技術：
1、纈氨酸(valine)是一種支鏈氨基酸(branched?chain?amino?acids,bcaa)，分子式c5h11no2，為白色結晶或粉末，溶于水，密度1.316g/cm3。纈氨酸分子是手性分子，根據(jù)偏振光的旋轉方向分為d型和l型，天然的纈氨酸都為l-纈氨酸。l-纈氨酸是人體必需氨基酸之一，自身不能合成，必須通過膳食來源獲得補充，其具有多種生理功能，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品以及飼料等領域。
2、微生物細胞可以直接合成l-纈氨酸，通過大量培養(yǎng)微生物，利用其代謝反應進行合成。目前世界上l-纈氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)大都采用此方法，使用的生產(chǎn)菌株有大腸桿菌(escherichia?coli)，谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutacium)、黃色短桿菌(brevibacterium?flavum)，北京棒桿菌(corynebacterium?pekineise)等亞種，粘質賽氏桿菌(serratia?marcescens)，芽孢桿菌(bacillus)等。其中，大腸桿菌因其具有遺傳背景清晰、生長快速、基因編輯技術成熟等優(yōu)點，常被作為底盤細胞以生產(chǎn)多種不同的天然產(chǎn)物。
3、雖然微生物細胞可以直接合成l-纈氨酸，但胞內大量反饋抑制等調控網(wǎng)絡極大地限制了野生菌的生產(chǎn)能力。要想獲得高效生產(chǎn)l-纈氨酸的發(fā)酵菌株，必須有效解除微生物細胞內部的自我調節(jié)機制。近年來，隨著合成生物學和代謝工程的迅速發(fā)展，通過遺傳改造獲得能夠高效生產(chǎn)l-纈氨酸，且易于培養(yǎng)的重組工程菌株應運而生并取得了很好的效果。謝希賢等整合枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合酶的編碼基因alss，解除了l-纈氨酸對合成通路的反饋抑制，同時整合大腸桿菌ppgpp3’-焦磷酸水解酶的突變基因spotm，增強了丙酮酸供應，提高出發(fā)菌株vhy03的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)l-纈氨酸水平(zl2020009206)。
4、在大腸桿菌生產(chǎn)l-纈氨酸的代謝通路中，如圖1，丙酮酸是纈氨酸的前體物質，同時又連接著細胞生長所必需的tca循環(huán)，直接敲除該循環(huán)中關鍵酶會使得tca循環(huán)阻斷，導致細胞生長受到嚴重影響，進而纈氨酸產(chǎn)量發(fā)生降低，因此平衡菌體生長和產(chǎn)物積累成為代謝改造的關鍵。有研究表明，tca循環(huán)的強弱與琥珀酰輔酶a合成酶(succd)的轉錄水平有直接關系，故合理調控succd蛋白催化能力對纈氨酸工程菌至關重要。
技術實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明目的是提供一種在代謝工程改造過程中，平衡菌體生長所需的氨基酸合成和產(chǎn)物生成的一種通用方法。本發(fā)明通過對succ基因進行點突變，降低酶表達活性，達到碳流代謝平衡，進而實現(xiàn)提高纈氨酸產(chǎn)量的目的。并通過實驗篩選，得到了能夠顯著提高纈氨酸產(chǎn)量的重組菌株。
2、本發(fā)明提供一種succ突變體，其是相應于succ的野生型的氨基酸的下述至少一個位點存在突變：l17、s36、g53、a125、l223或f286。
3、所述突變是根據(jù)succ野生型序列進行分子對接，模擬出不同突變位點的序列，突變型蛋白會降低一定酶催化能力，同時又保留部分蛋白活性，使得菌株在能夠正常生長的同時提高l-纈氨酸的積累。
4、具體地，其是相應于succ的野生型的氨基酸的下述至少一個位點存在突變：l17s、s36p、g53a、a125d、l223p、f286s。
5、本發(fā)明提供所述的succ突變體的編碼核酸。
6、本發(fā)明也提供含有所述編碼核酸的重組表達載體。
7、本發(fā)明進一步提供含有所述重組表達載體的重組菌，優(yōu)選地，其是大腸桿菌。
8、本發(fā)明還提供如上所述的succ突變體的編碼核酸、所述編碼核酸、所述重組表達載體或所述的重組菌在制備l-纈氨酸中的應用。
9、本發(fā)明尤其提供一種提高l-纈氨酸產(chǎn)量的生產(chǎn)菌株，其通過如下方法得到：
10、s1:為實現(xiàn)基因組中單點突變，根據(jù)crispr-cas9原理，編輯成功后的基因組中不能存在pam位點對應的原n20序列，需對初始菌(具體如大腸桿菌sva1024和野生型大腸桿菌atcc8739)分別構建一株通用型底盤菌。具體為對succ基因進行20bp特定位點突變，獲得第一改造菌株；
11、s2:將如權利要求3所述編碼核酸分別對第一改造菌株中succ基因進行相應的點突變和20bp特定位點回復突變，獲得第二改造的l-纈氨酸生產(chǎn)菌株。
12、本發(fā)明進一步提供一種制備l-纈氨酸的方法，其包括所述的重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)以獲得l-纈氨酸的步驟，任選地，還包括分離所述l-纈氨酸的步驟。
13、在一個具體實施方式，通過發(fā)酵結果可以看出，本發(fā)明改造得到的菌株能夠明顯提高纈氨酸的產(chǎn)量，例如初始菌sva1024由原先的1.3g/l提高為1.61g/l，產(chǎn)量提高了23.8％，野生型菌株e.coli?atcc8739由原先的0提高為0.11g/l，l-纈氨酸有明顯積累，為進一步產(chǎn)業(yè)化提供了有力的菌株支持。
1.一種succ突變體，其特征在于，其是相應于succ的野生型的氨基酸序列存在s36p突變；所述succ野生型的氨基酸的序列是由seq?id?no.1所示的核苷酸序列編碼得到。
2.如權利要求1所述的succ突變體，其特征在于，還包括以下至少一處突變：l17s、g53a、a125d、l223p、f286s。
3.如權利要求1或2所述的succ突變體的編碼核酸。
4.含有如權利要求3所述編碼核酸的重組表達載體。
5.含有如權利要求4所述重組表達載體的重組菌，所述重組菌中野生型succ被權利要求1或2所述的succ突變體替換，所述重組菌是大腸桿菌。
6.如權利要求1或2所述的succ突變體、如權利要求3所述編碼核酸、如權利要求4所述重組表達載體或如權利要求5所述的重組菌在制備l-纈氨酸中的應用。
7.一種l-纈氨酸生產(chǎn)菌株，其特征在于，通過如下方法得到：
8.如權利要求7所述的l-纈氨酸生產(chǎn)菌株，其特征在于，所述初始大腸桿菌是野生大腸桿菌，或能夠產(chǎn)l-纈氨酸的大腸桿菌。
9.一種制備l-纈氨酸的方法，其特征在于，其包括如權利要求7所述的l-纈氨酸生產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)以獲得l-纈氨酸的步驟。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)是厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。