本發(fā)明涉及微生物，涉及一種2-鹵代酸脫鹵酶及其基因、工程菌與其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
2、有機(jī)鹵代物可以通過非生物和生物方法進(jìn)行降解，而生物法以其高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好等特點越來越受到重視。微生物是自然界重要的生產(chǎn)者和有機(jī)物的主要分解者，可以將各種復(fù)雜的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為簡單的化合物，從而保持生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)。其中，降解有機(jī)鹵代物的微生物存在催化脫鹵作用的酶，這類酶被稱為脫鹵酶。2-鹵代酸脫鹵酶（ec3.8.1.x）是催化2-鹵代酸脫鹵水解形成相應(yīng)的2-羥基酸的一類水解型脫鹵酶，不僅能夠以一種低能耗途徑降解環(huán)境中的鹵代污染物，而且具有寬廣底物譜和高效催化效率，因而在環(huán)境修復(fù)中具有巨大應(yīng)用價值。目前分離獲得的2-鹵代酸脫鹵微生物已遍布于原核生物和真菌。
3、與細(xì)菌相比，絲狀真菌由于所產(chǎn)生的菌絲體容易捕捉氣相中的疏水性污染物，同時又具備耐低ph值和適應(yīng)高溫、干燥環(huán)境等特性，日益成為新的研究熱點。木霉（ trichodermaspp.）屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、木霉屬，是一種重要的多功能的絲狀真菌，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的植病生防菌株，是土壤環(huán)境中有毒物質(zhì)的降解菌株，是復(fù)合微生物有機(jī)肥和全元生物有機(jī)肥中重要的微生物菌種之一，也是工業(yè)生產(chǎn)中重要的酶和代謝產(chǎn)物的工程菌，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。但是，目前還未見有木霉降解鹵代污染物的相關(guān)報道，據(jù)發(fā)明人研究了解，基于木霉的代謝過程，其對有機(jī)鹵代物降解性能極低，因此無法用于鹵代污染物的降解。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明基于綠色木霉?( trichoderma?viride) tv-1511（已于2018年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為：cgmcc?no.16800）的進(jìn)一步對環(huán)境修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)了一個新的脫鹵酶——2-鹵代酸脫鹵酶基因 tvhad1，該脫鹵酶具有良好的降解鹵化物的能力，基于此，本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建了過表達(dá)2-鹵代酸脫鹵酶基因 tvhad1的木霉工程菌株，該工程菌具有良好的降解土壤中鹵化物的能力，基于上述研究成果，本發(fā)明提供一種2-鹵代酸脫鹵酶及其基因、工程菌與其構(gòu)建方法和應(yīng)用，
2、基于上述研究成果，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
3、第一方面，一種2-鹵代酸脫鹵酶，如以下任一所述：
4、（a1）其由seq?id?no.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
5、（a2）將（a1）經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
6、第二方面，一種2-鹵代酸脫鹵酶基因，用于表達(dá)本發(fā)明第一方面所述的2-鹵代酸脫鹵酶。
7、在一些實施方案中，所述基因的cds的核苷酸序列為如下(b1)~(b3)任意一種：
8、（b1）如seq?id?no.3所示的核苷酸序列；
9、（b2）如seq?id?no.3所示的核苷酸序列經(jīng)一個或多個核苷酸的替換、缺失或插入形成的序列；
10、（b3）在嚴(yán)格條件下能夠與如（b1）或（b2）所述的核苷酸序列雜交并編碼相同功能蛋白的核苷酸序列。
11、第三方面，一種重組表達(dá)載體，含有本發(fā)明第二方面所述的2-鹵代酸脫鹵酶基因的表達(dá)載體。
12、第四方面，一種工程菌，所述工程菌能夠過表達(dá)本發(fā)明第一方面所述的2-鹵代酸脫鹵酶。
13、第五方面，一種工程菌的構(gòu)建方法，將本發(fā)明第三方面所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入至出發(fā)菌株，使得構(gòu)建的工程菌株能夠過表達(dá)2-鹵代酸脫鹵酶。
14、第六方面，一種本發(fā)明第一方面所述的2-鹵代酸脫鹵酶或本發(fā)明第四方面所述的工程菌在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。
15、本發(fā)明的有益效果為：
16、本發(fā)明首次在綠色木霉tv-1511中克隆得到2-鹵代酸脫鹵酶基因 tvhad1，并利用表達(dá)載體和原生質(zhì)體融合的方法構(gòu)建了 tvhad1過表達(dá)的木霉工程菌株 tvhad1-oe。經(jīng)試驗證實了 tvhad1基因過表達(dá)可以增強(qiáng)綠色木霉菌降解土壤中鹵化物的能力，提高綠色木霉次級代謝產(chǎn)物的分泌。
1.一種2-鹵代酸脫鹵酶，其特征是，如以下任一所述：
2.一種2-鹵代酸脫鹵酶基因，其特征是，用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的2-鹵代酸脫鹵酶。
3.如權(quán)利要求2所述的2-鹵代酸脫鹵酶基因，其特征是，所述基因的cds的核苷酸序列為如下(b1)~(b3)任意一種：
4.一種重組表達(dá)載體，其特征是，含有權(quán)利要求2或3所述的2-鹵代酸脫鹵酶基因的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征是，所述的表達(dá)載體為為真菌質(zhì)粒，或，所述真菌質(zhì)粒為pbargpe1-hygro質(zhì)粒；
6.一種工程菌，其特征是，所述工程菌能夠過表達(dá)權(quán)利要求1所述的2-鹵代酸脫鹵酶。
7.如權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征是，所述工程菌為木霉屬；或，所述工程菌為綠色木霉；或，所述工程菌為綠色木霉?(trichoderma?viride)?tv-1511，保藏號為：cgmccno.16800。
8.一種工程菌的構(gòu)建方法，其特征是，將權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入至出發(fā)菌株，使得構(gòu)建的工程菌株能夠過表達(dá)2-鹵代酸脫鹵酶；
9.一種權(quán)利要求1所述的2-鹵代酸脫鹵酶或權(quán)利要求6或7所述的工程菌在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是，所述環(huán)境修復(fù)為降解有機(jī)鹵代物；優(yōu)選地，所述有機(jī)鹵代物為含有鹵素的染料；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述染料為溴酚藍(lán)或溴甲酚；