本發(fā)明涉及牛乳深加工，更具體的說是涉及一種健骨乳蛋白提取物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳清蛋白(whey?protein)是從牛奶中提取的一種蛋白質(zhì)，具有營養(yǎng)價(jià)值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點(diǎn)，是公認(rèn)的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一。乳清蛋白通常來源于奶酪加工的副產(chǎn)物，但由于我國飲食習(xí)慣與歐美國家存在較大差異，尚無大規(guī)模工業(yè)化奶酪工廠運(yùn)營，因此造成我國嬰兒配方奶粉所需的乳清粉大量依賴進(jìn)口。生產(chǎn)乳清粉的同時(shí)解決過剩酪蛋白的應(yīng)用問題，是乳品深加工產(chǎn)業(yè)的瓶頸，也是國內(nèi)乳品企業(yè)在拓展乳制品深加工產(chǎn)業(yè)化過程中的主要問題。將酪蛋白水解為功能肽，拓展應(yīng)用領(lǐng)域及場(chǎng)景，是行業(yè)迫切需要解決的問題。

2、乳源生物活性肽是從乳蛋白(如酪蛋白和乳清蛋白)中通過酶解或微生物發(fā)酵釋放出的具有特定生物活性的小分子多肽，其分子量通常較低，易被人體吸收，隨著不同功能的乳源性活性肽的發(fā)現(xiàn)，乳蛋白活性肽的研究已成為生理學(xué)界和營養(yǎng)學(xué)界的研究新熱點(diǎn)。乳源生物活性肽的發(fā)現(xiàn)改變了過去對(duì)乳蛋白營養(yǎng)功能的單純?cè)u(píng)價(jià)，具有很好的應(yīng)用開發(fā)前景。

3、牛乳中含有多種功能各異的生物活性肽，具有重要的生理功能，尤其是在促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育、及疾病防治方面扮演著重要的作用。但天然牛乳中活性多肽的含量較少，無法滿足亞健康人群的需要。此外，還存在對(duì)乳源活性肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生理功能缺乏深入研究，傳統(tǒng)制備技術(shù)得率低、純度較低，無法開發(fā)出較高品質(zhì)的乳源活性肽等問題。

4、經(jīng)biopep數(shù)據(jù)庫檢索，來源于“casein”的活性肽就有111種，而酪蛋白生物活性肽的種類在不斷的被研究報(bào)道，其真實(shí)的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過111種。檢索web?ofscience(wos)核心數(shù)據(jù)庫，近25年“caseinpeptides”相關(guān)的研究有6080篇，“caseinpeptides?bone?density”相關(guān)研究有34篇。以酪蛋白為主要原料的、作用機(jī)理清晰的、具有專利技術(shù)的、強(qiáng)健骨骼的功能產(chǎn)品/配料，對(duì)乳制品深加工產(chǎn)業(yè)化及滿足特定人群的功效需求，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

5、現(xiàn)有技術(shù)中，cn202210987021.1公開了一種促進(jìn)骨骼發(fā)育的水牛酪蛋白水解肽制備方法與應(yīng)用，其主要將水牛酪蛋白酶解，采用膜分離技術(shù)對(duì)水牛酪蛋白酶解液進(jìn)行分離，獲取分子量小于1kda的滲透物，主要成分為edvpser、navpitptl、vlpvpqk、hphphlsf四種，同時(shí)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該產(chǎn)物的增強(qiáng)骨密度效果。該方法得到的混合物中，edvpser、navpitptl兩條尚無功能驗(yàn)證相關(guān)報(bào)道，vlpvpqk作為酪蛋白磷酸肽的通用標(biāo)記物，廣泛用于嬰幼兒配方奶粉中cpp含量的定量檢測(cè)，而酪蛋白磷酸肽的健骨功效已被廣泛研究和報(bào)道。hphphlsf作為水牛乳酪蛋白酶解物及促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用，也于2016年曾有相關(guān)報(bào)道。因此尚無法佐證其水解肽的綜合效果。

6、cn202211530284.6公開了一種乳源活性肽gitdplfkgm、gitdplfkg及其獲得方法和應(yīng)用，該方法以牛乳濃縮蛋白為原料，使用副干酪乳桿菌發(fā)酵，然后采用超濾膜過濾，得到多肽混合物，對(duì)多肽混合物進(jìn)行分析、篩選得到乳源活性肽gitdplfkgm，該方法制備的乳源活性肽具有較高的抗氧化能力和免疫調(diào)節(jié)活性，但制備工藝較為復(fù)雜，且在健骨功能方面未見研究基礎(chǔ)及相關(guān)報(bào)道。

7、因此，如何采用工業(yè)化方法制備及篩選健骨乳蛋白提取物是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種健骨乳蛋白提取物及其制備方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種健骨活性肽，氨基酸序列為fypelfr，具體如seq?id?no.1所示：phe-tyr-pro-glu-leu-phe-arg(n端-c端)。

4、一種上述健骨活性肽的制備方法，具體包括以下步驟：

5、(1)巴氏殺菌

6、將脫脂乳進(jìn)行巴氏殺菌，得到滅菌脫脂乳；

7、(2)酪蛋白分離

8、將滅菌脫脂乳經(jīng)微濾膜進(jìn)行濃縮，洗濾，得到酪蛋白溶液；

9、(3)胃蛋白酶水解

10、將酪蛋白溶液調(diào)整ph值至1.5-3.0，加入胃蛋白酶進(jìn)行水解，得到胃蛋白酶水解液；

11、(4)胰蛋白酶水解

12、將胃蛋白酶水解液調(diào)整ph值至5.5-7.0，加入胰蛋白酶進(jìn)行水解，得到胰蛋白酶水解液；

13、(5)純化脫鹽

14、將胰蛋白酶水解液經(jīng)膜進(jìn)行過濾純化，納濾脫鹽，收集截留液，得到多肽混合物；

15、(6)分析篩選

16、將多肽混合物進(jìn)行分析篩選，即得健骨活性肽，氨基酸序列為fypelfr。

17、進(jìn)一步，上述步驟(1)中，巴氏殺菌的溫度為75-89℃，優(yōu)選為83-87℃；巴氏殺菌的時(shí)間為10-60s，優(yōu)選為13-17s。

18、進(jìn)一步，上述步驟(2)中，微濾膜為陶瓷膜或有機(jī)膜，優(yōu)選為陶瓷膜；微濾膜的膜孔徑為0.1μm、0.14μm或0.2μm，優(yōu)選為0.14μm；濃縮至原體積的20％-40％，優(yōu)選為30％；洗濾為加2-5倍體積的純凈水進(jìn)行洗濾，優(yōu)選為3倍。

19、進(jìn)一步，上述步驟(3)中，胃蛋白酶的加入量為1000-5000u/g蛋白，優(yōu)選為2000u/g蛋白；水解的溫度為35-45℃，優(yōu)選為36-38℃；水解的時(shí)間為1-3h，優(yōu)選為2h。

20、進(jìn)一步，上述步驟(4)中，胰蛋白酶的加入量為1000-5000u/g蛋白，優(yōu)選為2000u/g蛋白；水解的溫度為35-45℃，優(yōu)選為36-38℃；水解的時(shí)間為1-4h，優(yōu)選為2.5h。

21、進(jìn)一步，上述步驟(5)中，過濾純化的膜孔徑為500-5000da，優(yōu)選為500-2000da；納濾脫鹽的膜孔徑為1-100nm，優(yōu)選為1-10nm。

22、進(jìn)一步，上述步驟(6)中，分析篩選具體為：先使用lc-esi-q-tof高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)多肽混合物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合多肽組學(xué)鑒定對(duì)肽段氨基酸序列進(jìn)行分析；然后使用protein?data?bank(http://www.rcsb.org/pdb)數(shù)據(jù)庫獲取目標(biāo)受體蛋白αvβ1(pdb?id:3vi4)，使用autodockvina軟件進(jìn)行分子對(duì)接及親和能評(píng)分，選取高親和力的肽段，排除已公開的肽段。

23、一種健骨乳蛋白提取物，含有上述健骨活性肽。

24、一種上述健骨乳蛋白提取物的制備方法，具體包括以下步驟：

25、(1)巴氏殺菌

26、將脫脂乳進(jìn)行巴氏殺菌，得到滅菌脫脂乳；

27、(2)酪蛋白分離

28、將滅菌脫脂乳經(jīng)微濾膜進(jìn)行濃縮，洗濾，得到酪蛋白溶液；

29、(3)胃蛋白酶水解

30、將酪蛋白溶液調(diào)整ph值至1.5-3.0，加入胃蛋白酶進(jìn)行水解，得到胃蛋白酶水解液；

31、(4)胰蛋白酶水解

32、將胃蛋白酶水解液調(diào)整ph值至5.5-7.0，加入胰蛋白酶進(jìn)行水解，得到胰蛋白酶水解液；

33、(5)純化脫鹽

34、將胰蛋白酶水解液經(jīng)膜進(jìn)行過濾純化，納濾脫鹽，收集截留液，得到多肽混合物；

35、(6)濃縮干燥

36、將多肽混合物進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，即得健骨乳蛋白提取物。

37、通過本發(fā)明上述方法進(jìn)行健骨乳蛋白提取物的制備，可獲得特征多肽fypelfr的含量較高的多肽混合物，提升產(chǎn)品的健骨功效。同時(shí)，該提取物中的健骨活性肽可以是單一肽段，也可以是多肽混合物或組合物。對(duì)于單一肽段，可以通過酪蛋白溶液經(jīng)酶解分離純化方法制備、通過化學(xué)合成方法制備或通過生物合成方法制備，優(yōu)選為通過酪蛋白溶液經(jīng)酶解分離純化方法制備或通過生物合成方法制備，更優(yōu)選為通過酪蛋白溶液經(jīng)酶解分離純化方法制備。對(duì)于多肽混合物，可以由酶解純化方法制備和生物合成混合方法制備，優(yōu)選為通過酪蛋白溶液經(jīng)酶解分離純化方法制備。特征多肽組合物，包括健骨活性肽fypelfr及其衍生物。

38、進(jìn)一步，上述步驟(1)中，巴氏殺菌的溫度為75-89℃，優(yōu)選為83-87℃；巴氏殺菌的時(shí)間為10-60s，優(yōu)選為13-17s。

39、進(jìn)一步，上述步驟(2)中，微濾膜為陶瓷膜或有機(jī)膜，優(yōu)選為陶瓷膜；微濾膜的膜孔徑為0.1μm、0.14μm或0.2μm，優(yōu)選為0.14μm；濃縮至原體積的20％-40％，優(yōu)選為30％；洗濾為加2-5倍體積的純凈水進(jìn)行洗濾，優(yōu)選為3倍。

40、進(jìn)一步，上述步驟(3)中，胃蛋白酶的加入量為1000-5000u/g蛋白，優(yōu)選為2000u/g蛋白；水解的溫度為35-45℃，優(yōu)選為36-38℃；水解的時(shí)間為1-3h，優(yōu)選為2h。

41、進(jìn)一步，上述步驟(4)中，胰蛋白酶的加入量為1000-5000u/g蛋白，優(yōu)選為2000u/g蛋白；水解的溫度為35-45℃，優(yōu)選為36-38℃；水解的時(shí)間為1-4h，優(yōu)選為2.5h。

42、進(jìn)一步，上述步驟(5)中，過濾純化的膜孔徑為500-5000da，優(yōu)選為500-2000da；納濾脫鹽的膜孔徑為1-100nm，優(yōu)選為1-10nm。

43、進(jìn)一步，上述步驟(6)中，濃縮的方法為ro濃縮，跨膜壓差為1.0-2.5mpa，溫度為10-25℃；冷凍干燥的溫度為-50～-30℃，壓力為0.03mpa，時(shí)間為24-48h。

44、本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種上述健骨活性肽或上述制備方法制得的健骨活性肽的衍生物，包括在健骨活性肽fypelfr的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、氨基端或羧基端進(jìn)行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙?；⒘姿峄?、酯化或糖基化修飾所得到的多肽衍生物。

45、本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種上述健骨活性肽、上述含有健骨活性肽的健骨乳蛋白提取物或上述健骨活性肽的衍生物在制備具有健骨功效的食品(尤其包括保健品，質(zhì)量百分含量為1.0％-2％)或藥物中的應(yīng)用，可獲得較佳的健骨活性。

46、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

47、1、本發(fā)明健骨活性肽及含有其的健骨乳蛋白提取物能夠與整合素αvβ1通過疏水作用和氫鍵結(jié)合，通過激活特定的信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，可用于健骨功能食品或藥物的開發(fā)，對(duì)牛乳精深加工具有重要意義。

48、2、本發(fā)明先以脫脂乳為原料，經(jīng)殺菌、酪蛋白分離得到酪蛋白溶液，再經(jīng)胃蛋白酶水解、胰蛋白酶水解、兩步膜過濾純化、一步純化脫鹽得到多肽混合物，最后對(duì)多肽混合物進(jìn)行分析篩選得到功效理想的健骨活性肽fypelfr，該制備方法簡(jiǎn)單高效，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，應(yīng)用范圍廣。

49、3、本發(fā)明以特定的原料和酶解方法水解牛乳酪蛋白后，分析篩選獲得了一條具有理想健骨功效的新多肽，豐富了乳源生物活性肽的種類，為制備健骨功效產(chǎn)品提供了新的原料。