本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及宿主細(xì)胞nf90基因作為抗豬德爾塔冠狀病毒靶點(diǎn)在制備抗豬德爾塔冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬德爾塔冠狀病毒(pdcov)是δ屬冠狀病毒，既可感染禽類又可感染哺乳動(dòng)物，目前主要感染生豬，可引起仔豬嚴(yán)重腹瀉和脫水，呈現(xiàn)高死亡率，且存在垂直傳播和橫向傳播的特點(diǎn)。目前，pdcov主要在中國(guó)、美國(guó)和東南亞等國(guó)家及地區(qū)流行，且流行毒株復(fù)雜、流行率逐年增高，嚴(yán)重危害了這些地區(qū)級(jí)國(guó)家生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，pdcov最大的威脅在于其強(qiáng)大的重組變異和跨宿主傳播能力，且由于病毒在自然選擇壓力下不斷重組進(jìn)化，廣譜非特異的抗病毒藥物會(huì)導(dǎo)致其耐藥性增加，因此，最佳解決方案是開發(fā)針對(duì)pdcov的特異性抗病毒藥物和疫苗。

2、近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)nf90蛋白(核因子90蛋白)具有廣譜的抗病毒活性，例如xi?wen等揭示nf90能夠與蛋白激酶r(pkr)相互作用，促進(jìn)pkr的磷酸化，從而激活應(yīng)激顆粒(stress?granules,sgs)的形成，這些應(yīng)激顆?？梢宰柚共《緈rna的翻譯，從而抑制病毒的復(fù)制(doi:10.4049/jimmunol.1302813)；中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所陳玲玲研究組發(fā)現(xiàn)nf90及其家族成員nf110可以結(jié)合環(huán)形rna(circrna)，在病毒感染時(shí)，nf90/nf110從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并釋放到病毒mrna上，抑制病毒的復(fù)制(doi:10.1016/j.molcel.2017.05.023)；中國(guó)專利申請(qǐng)文獻(xiàn)cn109266731a公開的tim-3與nf90的相互作用在預(yù)防或治療病毒感染產(chǎn)品中的應(yīng)用，利用標(biāo)記物tim-3與其相互作用的nf90可以對(duì)病毒感染進(jìn)行預(yù)防或治療。然而，nf90蛋白對(duì)pdcov的抑制作用尚未有見(jiàn)于研究報(bào)道，亦未有針對(duì)pdcov的有效的nf90蛋白相關(guān)的抗病毒藥物。

3、程序性核糖體移碼(programmed?ribosomal?frameshift，prf)是由rna結(jié)構(gòu)和rna結(jié)合蛋白共同調(diào)控發(fā)生的翻譯重編碼事件。在翻譯延伸階段，核糖體沿mrna的5′–3′方向移動(dòng)時(shí)，可能于特定位置發(fā)生高頻的向后(-1或-2位)或向前(+1位)滑動(dòng)，從而切換至新的閱讀框繼續(xù)合成新的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有研究顯示，數(shù)百種rna病毒可利用-1位prf翻譯的機(jī)制在基因組翻譯過(guò)程中控制病毒蛋白的化學(xué)計(jì)量比，進(jìn)而調(diào)控病毒增殖。但是，病毒prf效率需要受到精準(zhǔn)調(diào)節(jié)維持在最適病毒增殖的比例范圍內(nèi)，促進(jìn)或者抑制prf效率均會(huì)抑制病毒增殖。

4、針對(duì)pdcov，如何靶向調(diào)控其prf的rna結(jié)合蛋白或rna結(jié)構(gòu)元件以抑制其增殖，并作為抗抗豬德爾塔冠狀病毒藥物靶標(biāo)，仍是亟待解決的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述指出的針對(duì)豬德爾塔冠狀病毒的尚未有有效的針對(duì)性藥物以及如何靶向調(diào)控豬德爾塔冠狀病毒程序性核糖體移碼以抑制其增殖等問(wèn)題，本技術(shù)提出宿主細(xì)胞nf90基因作為抗豬德爾塔冠狀病毒靶點(diǎn)在制備抗豬德爾塔冠狀病毒藥物中的應(yīng)用，本技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)nf90基因表達(dá)的nf90蛋白可結(jié)合pdcov移碼刺激元件rna，促進(jìn)pdcov程序性核糖體移碼，促進(jìn)病毒增殖；因此，可通過(guò)nf90基因或nf90蛋白抑制劑抑制pdcov增殖，為治療或預(yù)防pdcov感染提供了有效防治手段。具體技術(shù)方案如下

2、首先，本發(fā)明提出nf90基因作為抗pdcov靶點(diǎn)在制備抗pdcov藥物中的應(yīng)用；所述nf90基因在ncbi中的參考序列編號(hào)為xm_021083796.1。

3、其次，本發(fā)明提出nf90基因抑制劑在制備抗pdcov藥物中的應(yīng)用；所述nf90基因在ncbi中的參考序列編號(hào)為xm_021083796.1；

4、優(yōu)選的，所述nf90基因抑制劑包括對(duì)nf90基因具有抑制作用的shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反義rna/dna、小分子化合物、肽、抗體中的任意一種或多種。

5、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述nf90基因抑制劑為sirna，該sirna的序列為：

6、sense(5′to?3′)：gagcaggagaaagucaacatt，

7、antiense(5′to?3′)：uguugacuuucuccugcuctt；

8、再次，本發(fā)明提出nf90蛋白抑制劑在制備抗pdcov藥物中的應(yīng)用；所述nf90蛋白在ncbi中的參考序列編號(hào)為xp_020939455.1；

9、優(yōu)選的，所述nf90蛋白抑制劑包括對(duì)nf90蛋白具有抑制作用的shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反義rna/dna、小分子化合物、肽、抗體中的任意一種或多種。

10、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述nf90蛋白抑制劑為小分子化合物ym-155，其化學(xué)式為4,9-二氫-1-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-4,9-二氧代-3-(2-吡嗪甲基)-1h-萘并[2,3-d]咪唑溴化物。

11、另外，本發(fā)明還提供一種抗pdcov藥物，其主要有效成分或有效成分之一為nf90基因抑制劑和/或nf90蛋白抑制劑；

12、優(yōu)選的，所述nf90基因抑制劑和/或nf90蛋白抑制劑包括對(duì)nf90基因和/或nf90蛋白具有抑制作用的shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反義rna/dna、小分子化合物、肽、抗體中的任意一種或多種。

13、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述有效成分為nf90基因抑制劑sirna，該sirna的序列為：

14、sense(5′to?3′)：gagcaggagaaagucaacatt，

15、antiense(5′to?3′)：uguugacuuucuccugcuctt。

16、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述有效成分為nf90蛋白抑制劑小分子化合物ym-155，其化學(xué)式為4,9-二氫-1-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-4,9-二氧代-3-(2-吡嗪甲基)-1h-萘并[2,3-d]咪唑溴化物，其結(jié)構(gòu)式如下：

17、

18、優(yōu)選的，所述nf90蛋白抑制劑小分子化合物ym-155的濃度范圍為≤20nmol/l。

19、優(yōu)選的，所述nf90蛋白抑制劑小分子化合物ym-155的接種量為0.1mg/kg。

20、本發(fā)明的有益效果：

21、1)首先，本發(fā)明提供了一個(gè)新的抗pdcov靶點(diǎn)—宿主nf90基因。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，nf90基因過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的nf90蛋白可促進(jìn)pdcov程序性核糖體移碼，促進(jìn)病毒增殖；因此，通過(guò)下調(diào)宿主nf90基因表達(dá)水平，可有效抑制pdcov的程序性核糖體移碼效率和病毒復(fù)制，為抗豬德爾塔冠狀病毒藥物的研發(fā)提供了新思路及新途徑。

22、2)其次，本發(fā)明驗(yàn)證了nf90基因抑制劑sinf90-442可有效敲低nf90蛋白的表達(dá)效率，nf90蛋白抑制劑ym-155在細(xì)胞水平和病毒感染的雞胚模型中均可抑制pdcov增殖，為治療或預(yù)防pdcov感染提供了多種有效防治手段。

23、3)再次，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，nf90蛋白抑制劑ym-155在細(xì)胞水平對(duì)豬回腸上皮細(xì)胞(ipi-2i)和腎小管上皮細(xì)胞(llc-pk1)中的pdcov增殖均有有效抑制作用，證明其對(duì)pdcov的抑制效果不存在細(xì)胞特異性，具有良好的應(yīng)用前景。

24、4)另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，nf90抑制劑ym-155在雞胚模型中對(duì)pdcov增殖抑制的安全有效濃度為0.1mg/kg，為抗pdcov藥物的研發(fā)進(jìn)一步提供了研發(fā)基礎(chǔ)。

25、5)此外，本發(fā)明中nf90基因作為靶點(diǎn)抗病的原理是，其表達(dá)的nf90蛋白可促進(jìn)pdcov程序性核糖體移碼，促進(jìn)病毒增殖，通過(guò)下調(diào)宿主nf90蛋白表達(dá)水平，以抑制pdcov的程序性核糖體移碼效率和病毒復(fù)制；因此除了所列的nf90基因抑制劑、nf90蛋白抑制劑ym-155，其他的與nf90蛋白表達(dá)相關(guān)的shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反義rna/dna、小分子化合物、肽、抗體等可靶向抑制宿主細(xì)胞nf90蛋白表達(dá)的手段，合理推斷均有抑制pdcov感染的效果。