本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種重組桿狀病毒穿梭載體bacmid'的構建方法。

背景技術：

1、桿狀病毒表達系統(tǒng)憑借其高效、安全及翻譯后修飾能力接近哺乳動物細胞的優(yōu)勢，在多個領域得到了廣泛應用。桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)可高效表達復雜蛋白（如糖蛋白、跨膜蛋白），且支持正確的折疊、糖基化及磷酸化修飾。

2、桿狀病毒表達系統(tǒng)（baculovirus?expression?vector?system,?bevs）自20世紀80年代發(fā)展以來，已成為真核生物重組蛋白表達的金標準工具。其核心依賴于桿狀病毒（如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒acmnpv）對昆蟲細胞的特異性感染能力，結合強效的多角體蛋白（polyhedrin）或p10啟動子驅動外源基因高效表達。相較于原核表達系統(tǒng)，bevs具備完整的真核翻譯后修飾功能（如糖基化、磷酸化），可生產具有天然構象及生物活性的復雜蛋白（如病毒囊膜蛋白、細胞表面受體），這一特性使其在疫苗開發(fā)（如hpv疫苗、流感疫苗）及治療性抗體生產中占據(jù)不可替代的地位。

3、近年來，bevs的技術革新進一步拓展了其應用邊界?；凇癰ac-to-bac”系統(tǒng)的快速重組策略，結合轉座酶介導的定點整合技術，顯著縮短了重組病毒構建周期（從數(shù)周至數(shù)日）。此外，雙/多基因共表達系統(tǒng)的優(yōu)化（如利用p10與polyhedrin雙啟動子）實現(xiàn)了多亞基蛋白復合體（如病毒樣顆粒vlps）的高效組裝。在工業(yè)級生產中，昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)（如sf9、high?five細胞）已通過fda認證，支持大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，其蛋白產量可達毫克至克級/升，遠超哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。

4、在生物醫(yī)藥領域，bevs的應用已從基礎研究延伸至臨床轉化。例如，covid-19疫情期間，基于桿狀病毒表達的sars-cov-2?spike蛋白被廣泛用于疫苗研發(fā)（如novavax疫苗）。還用于生產抗體，表達全長igg抗體（如pd-1單抗）。同時，其在基因治療載體（如aav）生產中的適配性革新，解決了傳統(tǒng)哺乳動物系統(tǒng)產能低、成本高的瓶頸。值得注意的是，bevs的安全性優(yōu)勢（無人類致病性、嚴格的物種特異性）進一步降低了生物安全風險，使其成為gmp級生產的優(yōu)選平臺。

5、但傳統(tǒng)bacmid系統(tǒng)存在重組病毒傳代不穩(wěn)定的問題：外源基因在病毒連續(xù)傳代過程中易丟失，如野生型bacmid（wtbacmid，bmon14272）在5代后丟失率達到50%以上，這種高丟失率限制了bacmid病毒作為毒種在生產上應用。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對wtbacmid系統(tǒng)的核心矛盾——minif與atttn7轉座位點的共定位冗余性的問題，提供一種重構的新型桿狀病毒穿梭載體bacmid'及其構建方法。本發(fā)明將wtbacmid載體中細菌人工染色體（bac，包含kanr、laczα-atttn7、minif）片段體外重組，采用遷移minif保留kanr、laczα-atttn7的方式來拆分bac片段。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下方案來實現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一種重構的桿狀病毒穿梭載體bacmid'的構建方法，包括如下步驟：

4、s1、將laczα-atttn7序列克隆至反向擴增后的桿狀病毒轉移載體pbacpak8中，獲得重組質粒pbacpak8-laczα-atttn7；

5、s2、將重組質粒pbacpak8-laczα-atttn7與缺陷型病毒bacmid（rd-acbacmid）共轉染sf9細胞，所得病毒進行擴增、超高速離心，得到重組病毒acnpv-laczα-atttn7；

6、s3、將重組病毒acnpv-laczα-atttn7?dna與pbvbac轉化dh10b感受態(tài)細胞，利用藍白斑篩選，即得重組桿狀病毒穿梭載體bacmid'；

7、步驟s3中，所述pbvbac是將vcath、minif、chitinase克隆到puc19得到的。

8、作為本發(fā)明的一個實施方案，步驟s1中，laczα-atttn7片段是以bacmid為模板，設計引物laczα-f和laczα-r擴增得到。引物laczα-f的基因序列如seq?id?no.3所示，laczα-r的基因序列如seq?id?no.4所示。

9、作為本發(fā)明的一個實施方案，步驟s1中，反向擴增的引物為orf1629-f和orf603-r；orf1629-f的基因序列如seq?id?no.1所示，orf603-r的基因序列如seq?id?no.2所示。

10、作為本發(fā)明的一個實施方案，步驟s3中，所述pbvbac是將vcath、minif、kanr、chitnase克隆到puc19，以此為模板，通過包含hindiii酶切位點的一對引物進行反向擴增，去除kanr基因，自連成pbvbac。

11、vcath、minif、kanr、chit克隆到puc19，是將線性化puc19載體與四個插入片段vcath、minif、kanr、chit再50℃下反應30?min。線性化puc19載體、vcath、minif、kanr、chit的用量比為50~200?ng：10~200?ng：10~200?ng：10~200?ng：10~200?ng。

12、一對引物為vcath-hindiii和ori2-hindiii；vcath-hindiii的基因序列如seq?idno.15所示，ori2-hindiii的基因序列如seq?id?no.16所示。

13、作為本發(fā)明的一個實施方案，步驟s3中，acnpv-laczα-atttn7?dna與pbvbac轉化dh10b感受態(tài)細胞，利用藍白斑篩選重組克隆，藍斑克隆即為本發(fā)明的產物。

14、本發(fā)明還提供了一種所述重構的桿狀病毒穿梭載體bacmid'在重組蛋白表達中的應用。

15、本發(fā)明為了實現(xiàn)細菌細胞內重組，克隆vcath-minif-chitinase到puc19產生pbvbac。通過acnpv-laczα-atttn7?dna與線性化的pbvbac片段共轉化dh10b感受態(tài)細胞。為特異性遷移wtbacmid載體中的minif元件并保留laczα-atttn7功能模塊，本發(fā)明先將laczα-atttn7序列克隆至桿狀病毒轉移載體pbacpak8，獲得重組質粒pbacpak8-laczα-atttn7。該載體攜帶orf603與orf1629同源臂以及l(fā)aczα-atttn7，可通過昆蟲細胞內的同源重組機制與缺陷型病毒載體rd-acbacmid（一種自制的bac10:ko1629載體）對應區(qū)域進行置換，從而獲得攜帶目標元件的重組病毒。重組質粒pbacpak8-laczα-atttn7與缺陷型病毒bacmid（rd-acbacmid）共轉染sf9細胞得到重組病毒acnpv-laczα-atttn7。經超高速離心分離純化病毒，抽提病毒dna備用。

16、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

17、（1）本發(fā)明通過拆離wtbacmid載體bac片段中與laczα-atttn7共定位的minif復制子，使之遷移到chitinase-vcath基因座，成功構建了桿狀病毒穿梭載體bacmid'?；谠撦d體的重組病毒可穩(wěn)定克隆大片段外源基因，可以作為規(guī)?；a用病毒載體使用，為基于桿狀病毒表達系統(tǒng)的疫苗開發(fā)及病毒學應用提供了有力的研究工具。

18、（2）bacmid'沿襲了bac-to-bac克隆外源基因的操作流程，因而基于該系統(tǒng)的轉移載體可以通用，無需另外構建專門轉移載體。

19、（3）由于minif復制子的插入使vcath（組織蛋白酶）和chitinase（幾丁質酶）基因失活，因而bacmid'病毒不會表達這2種蛋白酶，可改善重組靶蛋白的分泌，減少分泌和非分泌靶蛋白的降解，總體上提高桿狀病毒表達系統(tǒng)的效率和通用性。