：本發(fā)明屬于作物分子遺傳學(xué)和分子育種，特別是涉及一種與花生葉片持綠性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記c5-23及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、作為全球重要油料與經(jīng)濟(jì)作物，通過遺傳改良提升花生的持綠性、延緩葉片衰老，并深入研究葉綠素降解調(diào)控機(jī)制，對于培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)品種具有關(guān)鍵理論意義，已成為突破花生產(chǎn)量瓶頸的關(guān)鍵策略。

2、植物持綠性狀是植物生理學(xué)中描述葉片在衰老過程中保持葉綠素滯留和光合功能持續(xù)的特殊表型，是衰老進(jìn)程的“減速器”。在葉片衰老過程中葉綠素降解，光合系統(tǒng)ii(psii)活性持續(xù)下降，最終導(dǎo)致光合同化能力不可逆喪失，而持綠表型，則表現(xiàn)為葉片衰老進(jìn)程中葉綠素代謝速率顯著延緩，光合作用持續(xù)時(shí)間延長，這一特性對于延長作物灌漿期、提高籽粒充實(shí)度具有重要農(nóng)藝價(jià)值。而對植物庫源關(guān)系的研究被視為探索作物高產(chǎn)的途徑，一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)。“庫源理論(source-sink?theory)”，主要闡述了庫和源調(diào)控植物同化物的運(yùn)輸和分配的方式(龔月樺和高俊鳳，1999)?！霸础笔侵钢圃旌洼敵龉夂袭a(chǎn)物的器官，通常是指成熟的葉片；“庫”是指能夠接納和消耗光合產(chǎn)物的器官，通常是指果實(shí)，協(xié)調(diào)的庫源關(guān)系被視為作物高產(chǎn)的生理基礎(chǔ)(彭瀟瀟，2022)。源強(qiáng)度由源大小(葉面積)和源活性(單位面積凈光合速率)決定，(barnett?et?al.,1983；張英華等，2008)。葉綠素作為重要的“源”物質(zhì),是光合作用的基礎(chǔ),并且持綠性狀時(shí)間的長短直接決定著同化生物量的積累和產(chǎn)量潛力的大小(景蕊蓮，2007；farréet?al.,2016)。

3、持綠性狀相關(guān)qtl在其它多種作物基因組中亦被精確定位。例如，在番茄(lycopersicon?esculentum)(kerr,1956)、高粱(sorghum?bicolor)(vietor?et?al.,1989)、玉米(zea?mays?l.)(beavis?et?al.,1994)、大豆(glycine?max)(canfield?etal.,1995)、辣椒(capsicum?annuum)(alós?et?al.,2008)、水稻(oryza?sativa)(moritaet?al.,2010)、水稻(oryza?sativa?l)(fu?et?al.,2011)、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)(zhou?et?al.,2011)、小麥(triticum?aestivum?l.)(yang?et?al.,2016)、等重要農(nóng)作物的基因組中，研究人員均已通過遺傳定位技術(shù)成功鑒定鑒定出與持綠性狀相關(guān)的關(guān)鍵qtl區(qū)間。但目前對花生葉片持綠性狀的遺傳機(jī)制研究不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與花生葉片持綠性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記c5-23及其應(yīng)用，通過檢測與花生葉片持綠性狀相關(guān)基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記的基因型，對后代個體葉片持綠等位基因位點(diǎn)及性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，提高性狀的選擇效率、加快育種進(jìn)度，為加快花生新品種選育提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供一種與花生葉片持綠性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記c5-23，所述分子標(biāo)記c5-23位于花生第16號染色體7,402,289～7,878,548共476.3kb區(qū)間內(nèi)，其對應(yīng)的持綠花生品種m74的標(biāo)記前后2kb范圍的序列如seq?id?no.1所示，其對應(yīng)的早衰花生品種牙前大粒墩的標(biāo)記前后2kb范圍的序列如seq?id?no.2所示。

4、seq?id?no.1：

5、atttagattcatgctttcttctacttttgattctcaattcttgttgttacattcatcttcc

6、tctattcttttgttgtaatctcttctattttgtttccatgctttgttgtagatctactttt

7、gttccttctcttctcttttaattcaattagaggtaattcataataattgtgttccctttg

8、attgttgttattgatttcttacaataattgttgttagattttattgttgttatccatttac

9、tatgcttttctttagtgccttccaagtgtttgatgaaatgcttggttggattttagtgta

10、gattttgttcctcttggcctaggtggagtaattagtaatgcttgagtatctaattccttt

11、gtcgattgataattagaagttgctaattgatttggataccactaacgctagtctttccc

12、ttgggagttggctaggacttgtggaatcaagttgattcatccacttgactttcctccat

13、tattagaggttaactaagtggtagcaatggacaattgtggtcacaatcgaggaggata

14、actaggataggacttctaattctcacaaccttgccaagtgctttttagttgttagtttat

15、ttttattgtcatttacatttcatgtctcttatcccaaaaccccaaaatacaatccataac

16、caataacaagacactttattgtaattcctagggagaacgacccgagatttgaatactt

17、cggtttataaattttaggggtttgttttagtgacaaacaactttttgtatgaaagaatt

18、agtgattggtttagaaactatacttgcaacgagaattcatttgtgaaattctataccat

19、caaaaatccattcatcagccgtcccagttgcatccgaacagttgggtttcgatccgctg

20、ctttgagatggtttgtgaatatctggagctgccggtctccgttgaagtctttttgtttct

21、ttttactctgacgaatccctctaaagaggggaaggcgaagaaaggctttatgtcttttc

22、gatctgcccagggtcggaggatttttggtttttttgaggactcctaccatgggtttaaa

23、gataagtatttcaaggttcgtccaacggagggccatcacccattttggctgacgttgga

24、aggagaatgccgtatcctgacctattggagtttcggggcgggagccaacgcctttacc

25、aaagtgacatacaaagggttgtcctccgtgaataaaagggttgccgacgtcttattgg

26、ctgtatttgggaagaataatgttaatccccatcttcttatgagtgatcaggatgtagct

27、aggaattatattcatgagtagtgtttttttttatgactaacgagcttccgtgttctgtac

28、tagtgtcgatggctggcgagcaagttggccttgaagatttatttaacaccttccttgct

29、ggcgacagcgacgaggaaccggcccccgaaaaccaggccactgataatcaagaggat

30、ccttctcagaataccgtagaggccggagctcagtcccaaccctcccatggagctcagg

31、ccccaccctcccatggtgaggtaatcgggaatgatggtggcccagaacctcggccgga

32、gatcgaggtggagaatccagatgtgataatagtggacaatcagagaaagagaaaatc

33、gtcttctagcccggagtgagctctcaccgtgatggagaagaactttgatgccggggac

34、tttatcgattcccaactgctctcgagcacagaggacttcttccacggtggggatctccc

35、tgctcaggcgagatggatgtatcgctcgttgctccggggagccgctatagcgaggaag

36、gcggagtttgctctgactggggcatattttttggagaacaaacttgaatcctctgttca

37、agcaaacaacaaatacaaagctgaagtagagtcactttgggagcaactggctaccact

38、cgggagaagctggctattgctgcagagaaggttaagacttttgattccaccgtaggga

39、gatgactttggagagtcagctcaacgtcgctcaaggaaaggtgaaagaagccaaaaa

40、agagcgtgatgaacccctgtccttggcgactgcggctaaggatgaggcagccgaatta

41、aagagaaagtacaaggagaccgtgaagtagggaaagaacgccatcttgatgactgag

42、gaggccctcaaggctcaagtaaagctgctggctcccgacttcaatacctcagctgtta

43、gcgttttcaagaccatcaaggatgggaagattgtcgacatctcgaagaagtgatttgg

44、tcttgcctttgtactttgttttctgtaatatgtagatttttgtatacttttggctagcttg

45、actgtcattttttggtgtatgtaacaaggtagttgtggtgaactgggttgccgtttttg

46、gcagatatgcagctaattgcttgtctaccatcattgtttcttaccgttttactggtagtt

47、aatcgtttcgcttggtagtcgttggagccgatttgtggcttttaatattttgggttcccg

48、gggtgatcagtcccggggtgccgttttgttttgcttatttaagcgcgcaaagagaacac

49、ccctgagtttcaaataaaatctacgagacatgataatgataaagccgaataatataaa

50、cacggggtaaaacagacgacataaacaacaatcataagtcaaaagatcccgtataca

51、gcaatacaaatcttactcgcctggttgaacctggtaggtcgtttgctcgcctagcatgc

52、cttggctgctaggataaaacctccttaggttaaccgaattccatgtccttggtatttctt

53、tgccatcaagccgttccaatttgtaggccccattgccgagcacttctttcactttgtac

54、gggccttcccaatttgccgccagctttccttgcccgggtgttagtaacccgatatcgtt

55、gcgtcgcatgaccaggtcgtcccgctcgaattctctcttgagtaccttggcattgtagc

56、gcagagccatcttctgttttaacaccgtttccaacaagtgggccatctccctggcttca

57、tctaccaagtctttttctatggcttcgtcgactcctcctaggagtatccgcgggctcggt

58、tcgccgatctctacaggtattactgcgtctaccctatacgtgagttgaaaggggtctct

59、ccggtgctgggtcgtgcggtaggaccagaggactgatgctagctcgtccgcccatgtc

60、ccctttttctggtcaagtcgcttcttgaggccctgcaggatgaccttgttcaccgcttct

61、acttgtccgttagtctgaggatgttcaactgacgagaacttttgctgtatgcccaggct

62、ggcaagaaattctccgaatcttttatccgtgaactgggtcccaggatgttcaactgacg

63、acttccagtattccgaacctggctattatctgtctccacatggttggtcggttatcgga

64、cgatttaaggttgcttgttgggtgtgaaggtgggtccctgccttggcctggatcctggg

65、aatgagaagcgtgagcaaccgacttcccgagttcttcgcgaggtgaggggggtgccac

66、atgcaaggacactccgacgctcaagtcagtaggtgagcaggtggtgaagaggaaaag

67、ttatggtgacgtaccttgacccctccccctatatactgtgtcagaggtgggcccctcgt

68、ggacagacccaccttccgcgaagtttcccctgctagctgttgccaggtgagttggctcc

69、cagaagaaaaggtgtttgggtcaacagccggacgcgtggtgccccgctgaacgatcgc

70、ccggatccgtcaaggacgcgtgccagtcggatcaaccatggggccagctgggctgggc

71、cgcaataattattataataattaattaattattacaataattaataaatattaaatgagataaattatgactatttttaattgactttttttattatcaaatatttccgttaactc。

72、seq?id?no.2：

73、atttagattcatgctttcttctacttttgattctcaattcttgttgttacattcatcttcc

74、tctattcttttgttgtaatctcttctattttgtttccatgctttgttgtagatctactttt

75、gttccttctcttctcttttaattcaattagaggtaattcataataattgtgttccctttg

76、attgttgttattgatttcttacaataattgttgttagattttattgttgttatccatttac

77、tatgcttttctttagtgccttccaagtgtttgatgaaatgcttggttggattttagtgta

78、gattttgttcctcttggcctaggtggagtaattagtaatgcttgagtatctaattccttt

79、gtcgattgataattagaagttgctaattgatttggataccactaacgctagtctttccc

80、ttgggagttggctaggacttgtggaatcaagttgattcatccacttgactttcctccat

81、tattagaggttaactaagtggtagcaatggacaattgtggtcacaatcgaggaggata

82、actaggataggacttctaattctcacaaccttgccaagtgctttttagttgttagtttat

83、ttttattgtcatttacatttcatgtctcttatcccaaaaccccaaaatacaatccataac

84、caataacaagacactttattgtaattcctagggagaacgacccgagatttgaatactt

85、cggtttataaattttaggggtttgttttagtgacaaacaactttttgtatgaaagaatt

86、agtgattggtttagaaactatacttgcaacgagaattcatttgtgaaattctataccat

87、caaaaatccattcatcagccgtcccagttgcatccgaacagttgggtttcgatccgctg

88、ctttgagatggtttgtgaatatctggagctgccggtctccgttgaagtctttttgtttct

89、ttttactctgacgaatccctctaaagaggggaaggcgaagaaaggctttatgtcttttc

90、gatctgcccagggtcggaggatttttggtttttttgaggactcctaccatgggtttaaa

91、gataagtatttcaaggttcgtccaacggagggccatcacccattttggctgacgttgga

92、aggagaatgccgtatcctgacctattggagtttcggggcgggagccaacgcctttacc

93、aaagtgacatacaaagggttgtcctccgtgaataaaagggttgccgacgtcttattgg

94、ctgtatttgggaagaataatgttaatccccatcttcttatgagtgatcaggatgtagct

95、aggaattatattcatgagtagtgtttttttttatgactaacgagcttccgtgttctgtac

96、tagtgtcgatggctggcgagcaagttggccttgaagatttatttaacaccttccttgct

97、ggcgacagcgacgaggaaccggcccccgaaaaccaggccactgataatcaagaggat

98、ccttctcagaataccgtagaggccggagctcagtcccaaccctcccatggagctcagg

99、ccccaccctcccatggtgaggtaatcgggaatgatggtggcccagaacctcggccgga

100、gatcgaggtggagaatccagatgtgataatagtggacaatcagagaaagagaaaatc

101、gtcttctagcccggagtgagctctcaccgtgatggagaagaactttgatgccggggac

102、tttatcgattcccaactgctctcgagcacagaggacttcttccacggtggggatctccc

103、tgctcaggcgagatggatgtatcgctcgttgctccggggagccgctatagcgaggaag

104、gcggagtttgctctgactggggcatattttttggagaacaaacttgaatcctctgttca

105、agcaaacaacaaatacaaagctgaagtagagtcactttgggagcaactggctaccact

106、cgggagaagctggctattgctgcagagaaggttaagacttttgattccaccgttgcgc

107、ggcttaccgagagggagatgactttggagagtcagctcaacgtcgctcaaggaaaggt

108、gaaagaagccaaaaaagagcgtgatgaacccctgtccttggcgactgcggctaagga

109、tgaggcagccgaattaaagagaaagtacaaggagaccgtgaagtagggaaagaacgc

110、catcttgatgactgaggaggccctcaaggctcaagtaaagctgctggctcccgacttc

111、aatacctcagctgttagcgttttcaagaccatcaaggatgggaagattgtcgacatctc

112、gaagaagtgatttggtcttgcctttgtactttgttttctgtaatatgtagatttttgtat

113、acttttggctagcttgactgtcgttttttggtgtatgtaacaaggtagttgtggtgaac

114、tgggttgccgtttttggcagatatgcagctaattgcttgtctaccatcattgtttcttac

115、cgttttactggtagttaatcgtttcgcttggtagtcgttggagccgatttgtggctttta

116、atattttgggttcccggggtgatcagtcccggggtgccgttttgttttgcttatttaagc

117、gcgcaaagagaacacccctgagtttcaaataaaatctacgagacatgataatgataaa

118、gccgaataatataaacacggggtaaaacagacgacataaacaacaatcataagtcaa

119、aagatcccgtatacagcaatacaaatcttactcgcctggttgaacctggtaggtcgttt

120、gctcgcctagcatgccttggctgctaggataaaacctccttaggttaaccgaattccat

121、gtccttggtatttctttgccatcaagccgttccaatttgtaggccccattgccgagcact

122、tctttcactttgtacgggccttcccaatttgccgccagctttccttgcccgggtgttagt

123、aacccgatatcgttgcgtcgcatgaccaggtcgtcccgctcgaattctctcttgagtac

124、cttggcattgtagcgcagagccatcttctgttttaacaccgtttccaacaagtgggcca

125、tctccctggcttcatctaccaagtctttttctatggcttcgtcgactcctcctaggagta

126、tccgcgggctcggttcgccgatctctacaggtattactgcgtctaccctatacgtgagt

127、tgaaaggggtctctccggtgctgggtcgtgcggtaggaccagaggactgatgctagct

128、cgtccgcccatgtcccctttttctggtcaagtcgcttcttgaggccctgcaggatgacc

129、ttgttcaccgcttctacttgtccgttagtctgaggatgttcaactgacgagaacttttgc

130、tgtatgcccaggctggcaagaaattctccgaatcttttatccgtgaactgggtcccagg

131、atgttcaactgacgacttccagtattccgaacctggctattatctgtctccacatggtt

132、ggtcggttatcggacgatttaaggttgcttgttgggtgtgaaggtgggtccctgccttg

133、gcctggatcctgggaatgagaagcgtgagcaaccgacttcccgagttcttcgcgaggt

134、gaggggggtgccacatgcaaggacactccgacgctcaagtcagtaggtgagcaggtg

135、gtgaagaggaaaagttatggtgacgtaccttgacccctccccctatatactgtgtcag

136、aggtgggcccctcgtggacagacccaccttccgcgaagtttcccctgctagctgttgcc

137、aggtgagttggctcccagaagaaaaggtgtttgggtcaacagccggacgcgtggtgcc

138、ccgctgaacgatcgcccggatccgtcaaggacgcgtgccagtcggatcaaccatgggg

139、ccagctgggctgggccgcaataattattataataattaattaattattacaataattaa

140、taaatattaaatgagataaattatgactatttttaattgactttttttattatcaaatatttccgttaactc。

141、本發(fā)明還提供用于檢測所述與葉片持綠性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記c5-23的引物對，該引物對為c5-23-f/r，序列如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示：

142、c5-23-f:5`-ggagaagctggctattgctg-3`(seq?id?no.3)，

143、c5-23-r:5`-ctttcacctttccttgagcg-3`(seq?id?no.4)。

144、本發(fā)明還提供含有所述引物對的用于檢測葉片持綠性狀的試劑盒。

145、本發(fā)明還提供一種鑒定花生葉片持綠性狀的方法，包括以下步驟：

146、(1)提取待測花生葉片dna；

147、(2)采用引物對c5-23-f/r對所提取的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

148、(3)經(jīng)步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測，若出現(xiàn)119bp大小的特征條帶，則判定待測花生材料的表型為早衰型；若出現(xiàn)135bp大小的特征條帶，則判定待測花生材料的表型為持綠型；若同時(shí)出現(xiàn)119bp和135bp的特征條帶，則判定待測花生的表型為持綠型。

149、進(jìn)一步地，在步驟(2)中，所述pcr擴(kuò)增總體積10μl：dna模板100-200ng/μl1ul，引物對10um各0.5μl，2×taq?accurate?buffer?5μl，rnase?free?water?3μl。

150、進(jìn)一步地，在步驟(2)中，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸2min。

151、進(jìn)一步地，在步驟(3)中，采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

152、本發(fā)明還提供所述引物對或試劑盒在花生分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用，具體為：以持綠親本、早衰親本及其雜交后代的基因組dna為模板，用標(biāo)記c5-23的引物對對上述dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增和凝膠檢測，根據(jù)雜交后代個體的擴(kuò)增產(chǎn)物大小與親本的擴(kuò)增產(chǎn)物大小比較判定個體標(biāo)記的基因型，進(jìn)而判定葉片持綠性狀相關(guān)基因的基因型及該個體的葉片持綠性狀；若后代個體的標(biāo)記擴(kuò)增大小與持綠親本大小一樣，則該個體葉片持綠性狀相關(guān)基因的基因型是持綠親本型，其表型為持綠；若后代個體的標(biāo)記擴(kuò)增大小與早衰親本大小一樣，則該個體葉片持綠性狀相關(guān)基因的基因型是早衰親本型，其表型即為早衰；鑒于持綠對早衰為顯性，因而當(dāng)后代個體的標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物為父母本條帶都有，則該個體葉片持綠性狀相關(guān)基因的基因型是雜合型，該個體的表型為持綠。

153、本發(fā)明針對花生葉片持綠性狀遺傳機(jī)制研究不足的現(xiàn)狀，以早衰型品種牙前大粒墩與持綠型品種m74為親本構(gòu)建f2遺傳群體，綜合運(yùn)用multiple?bsa-seq、遺傳圖譜構(gòu)建及qtl驗(yàn)證，在花生16號染色體成功定位到一個主效qtl位點(diǎn)，其表型變異解釋率達(dá)16.49％。本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了花生持綠性狀的精準(zhǔn)遺傳定位，不僅為解析花生葉片衰老的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了關(guān)鍵靶點(diǎn)，更為分子標(biāo)記輔助選擇開發(fā)出具有實(shí)用價(jià)值的分子標(biāo)記。研究結(jié)果突破了花生持綠性狀遺傳改良的技術(shù)瓶頸，通過分子標(biāo)記輔助選擇葉片持綠性狀，在成熟期維持較高的光合效率的花生品種為提高花生產(chǎn)量潛力開辟了新途徑，對培育高產(chǎn)耐逆花生新品種具有重要應(yīng)用價(jià)值。

154、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

155、本發(fā)明提供的花生葉片持綠性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)的indel標(biāo)記c5-23，是一種簡便、精細(xì)和迅速的鑒定方法，其具有技術(shù)要求簡單和選擇效率高等優(yōu)點(diǎn)，與caps分子標(biāo)記相比，不需要經(jīng)過酶切、純化、回收等步驟，只需利用引物擴(kuò)增目的條帶并鑒定擴(kuò)增的目的條帶的基因型，就能夠?qū)⒒ㄉ某志G型和早衰型區(qū)分開，快速篩選花生雜交后代葉片持綠性狀的類型，輔助與葉片持綠性狀相關(guān)的株型育種、產(chǎn)量育種等；本發(fā)明的分子標(biāo)記能夠有效的鑒定花生的葉片持綠性狀，一方面有助于基因的精細(xì)定位、分離與克隆，另一方面對于花生的分子育種和品質(zhì)改良都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。