本發(fā)明屬于rna病毒檢測，具體涉及一種同步檢測人類嗜t細(xì)胞病毒亞型的多重?zé)晒舛縫cr試劑。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、人類嗜t細(xì)胞病毒（human?t-cell?leukemia?virus，htlv）是一種致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)其基因組差異性可分為四種亞型：htlv-1、htlv-2、htlv-3和htlv-4。htlv主要感染t淋巴細(xì)胞，與多種人類疾病相關(guān)，其中htlv-1和htlv-2與人類疾病關(guān)聯(lián)最密切。研究發(fā)現(xiàn)，雖然htlv-1與htlv-2在基因組結(jié)構(gòu)、復(fù)制模式及蛋白功能上高度相似，但二者的臨床致病性卻存在極大差異。htlv-1可導(dǎo)致成人t細(xì)胞白血病/淋巴瘤（adult?t-cell?leukemia/lymphoma,atll）和htlv相關(guān)性脊髓病（htlv-associated?myelopathy,ham）/熱帶痙攣性截癱（tropical?spastic?paraparesis,tsp），而htlv-2僅偶發(fā)脊髓病變，主要與淋巴細(xì)胞/血小板增多及癌癥死亡相關(guān)。此外，htlv-3和htlv-4的臨床致病性還有待研究。

2、目前，htlv感染診斷采用兩階段血清學(xué)檢測策略：初始階段采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked?immunosorbent?assay,elisa）或顆粒凝集試驗（particleagglutination?test，pat）進行初篩，疑似陽性樣本再進一步通過蛋白質(zhì)印跡試驗（western?blot,wb）或線性免疫分析(line?immunoassay,lia)確認(rèn)。需指出的是，僅憑血清學(xué)方法無法確定當(dāng)前的感染狀態(tài)，假陽性率較高，且無法進行病毒分型。在分子診斷領(lǐng)域，環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)（loop-mediated?isothermal?amplification,lamp）雖能實現(xiàn)病毒核酸直接檢測，但其對精密溫控和設(shè)備的要求限制了臨床推廣價值。相較而言，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time?fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction,qpcr）憑借其高靈敏度和特異性成為實驗室檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的單重qpcr存在檢測通量低（單次僅支持單靶標(biāo)檢測）、耗時長、單個檢測成本高等問題，制約了其在臨床大規(guī)模篩查中的應(yīng)用效能。重要的是，臨床中缺乏能夠同時檢測htlv-1、htlv-2、htlv-3、htlv-4的多重?zé)晒舛縫cr方法。因此，開發(fā)一種用于同步檢測人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型的多重?zé)晒舛縫cr檢測方法，對臨床htlv感染進行高效且準(zhǔn)確的篩查診斷具有非常重要的價值和意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明開發(fā)了一種基于多重?zé)晒舛縫cr技術(shù)的同步檢測人類嗜t細(xì)胞病毒亞型的方法，該方法通過特異性引物探針設(shè)計，可同時檢測htlv-1型四種亞型，具有靈敏度高、特異性強的特點。該技術(shù)不僅能準(zhǔn)確區(qū)分不同htlv亞型，還能對各亞型病毒的載量進行定量，為臨床診斷和治療策略制定提供重要技術(shù)支持。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明針對htlv-1、htlv-2、htlv-3、htlv-4的高度保守序列分別設(shè)計了特異性引物和探針；

3、針對人類嗜t細(xì)胞病毒1型的特異性引物為taytagatacaggagcrgacatgaca和tatcractargcaagatgttaaaacaata，探針為agctcacctcccttcctgtgctaatacgc；

4、針對人類嗜t細(xì)胞病毒2型的特異性引物為gaacccctcctgttggatctcyc和gaggtgtttgycccataacgga，探針為atcccgatcaagacatctcratactcccactc；

5、針對人類嗜t細(xì)胞病毒3型的特異性引物為ccaaaaagaacaccrrggctctga和aggtygctctccccttttatag，探針為tctctccctrccytgkctcccggaaaaaac；

6、針對人類嗜t細(xì)胞病毒4型的特異性引物為aaaggtcaactgtctcacacaaataa和ctgaaccatcctcatgcttatatag，探針為ctcaaaaccaggaaatccatagaaatgc。

7、本發(fā)明檢測試劑還包括用于多重?zé)晒舛縫cr檢測的其他常規(guī)試劑。

8、使用上述多重?zé)晒舛縫cr檢測試劑的方法如下：

9、1.收集醫(yī)院就診患者的血液樣本，采樣時系統(tǒng)性收集患者的相關(guān)臨床信息并登記入冊，運輸過程采用低溫保藏，后置于-80℃超低溫冰箱保存；

10、2.用天根病毒基因組dna/rna提取試劑盒提取血液中人類嗜t細(xì)胞病毒基因組rna；

11、3.以步驟2中提取的rna為模板，采用針對人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型基因組的特異性引物和探針，按照艾科瑞一步法試劑盒（ag11713）優(yōu)化后的反應(yīng)程序和反應(yīng)體系進行多重?zé)晒舛縫cr檢測，根據(jù)ct值進行結(jié)果判定；其中反應(yīng)程序為42℃逆轉(zhuǎn)錄5?min，95℃預(yù)變30?s；95℃變性5?s，59℃退火和延伸30?s，40個循環(huán)；在每個循環(huán)的延伸階段收集熒光信號。

12、檢測結(jié)果判讀包括如下內(nèi)容：

13、一、擴增曲線有效性判定

14、擴增曲線形態(tài)：曲線為標(biāo)準(zhǔn)"s"型，需滿足曲線平滑無鋸齒狀波動，平臺期表現(xiàn)正常；

15、閾值線設(shè)置要求：閾值線位于指數(shù)增長期中部，不應(yīng)過高或過低；

16、質(zhì)控要求：陰性對照與無模板對照ct值應(yīng)為undef、復(fù)孔間ct值差異應(yīng)＜0.5（否則需復(fù)測或重新提取核酸）；以108、105和102拷貝/μl的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對照，陽性對照擴增正常。以108、105和102拷貝/μl的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，各濃度梯度擴增曲線均符合上述擴增曲線有效性判定要求，表明陽性對照擴增結(jié)果有效。

17、結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

18、表1?人類嗜t細(xì)胞病毒（htlv）核酸檢測結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

19、；

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術(shù)效果：

21、本發(fā)明根據(jù)人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型的保守基因的高度保守區(qū)設(shè)計特異性引物，利用不同熒光標(biāo)記的針對不同病毒的特異性探針，實現(xiàn)在一個反應(yīng)體系中同時對人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型的檢測，在檢測病毒感染情況的同時還能對病毒的載量進行定量；

22、對該方法進行特異性驗證發(fā)現(xiàn)人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型與其他病原體之間均無交叉反應(yīng)，且特異性良好；該方法的靈敏度驗證發(fā)現(xiàn)人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型的最低檢出限均能達到100copies/μl，表明該方法具有高靈敏度；對該方法的重復(fù)性驗證發(fā)現(xiàn)，無論是批次內(nèi)重復(fù)性還是批次間重復(fù)性的變異系數(shù)均小于5%，表明該方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性良好。

23、本發(fā)明方法具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、操作簡單的優(yōu)點，可同步實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測htlv-1、htlv-2、htlv-3、htlv-4四種病毒亞型，為實驗室檢測區(qū)分這四種亞型的病毒提供了有效的技術(shù)手段；開發(fā)一管式同步檢測人類嗜t細(xì)胞病毒四種亞型的多重?zé)晒舛縫cr檢測試劑及技術(shù)方法，對于深入研究htlv不同亞型的分子特征、流行病學(xué)分布規(guī)律及致病機制具有重要的科研價值和臨床應(yīng)用意義。該技術(shù)將為htlv感染的精準(zhǔn)分型診斷、傳播溯源研究以及臨床防控策略制定提供可靠的技術(shù)支撐。