本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)，尤其涉及一種具有二氫葉酸還原酶活性的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、葉酸(維生素b9)是一種水溶性維生素，是葉酸(蝶酰基單谷氨酸)和具有葉酸生物活性的相關(guān)化合物的統(tǒng)稱。葉酸作為甲基供體參與人體內(nèi)多種生化代謝途徑，例如dna的復(fù)制、修復(fù)和甲基化以及核苷酸、維生素和一些氨基酸的合成。其中，具有生理活性的葉酸主要包括四氫葉酸(thf)、5-甲基四氫葉酸(5-mthf)、5,10-亞甲基四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸和10-甲酰四氫葉酸，而最易于人體吸收利用的葉酸的形式是5-mthf。
2、5-mthf是合成葉酸補(bǔ)充劑“蝶酰單谷氨酸(pmg)”的替代形式，可為人體立即提供還原性葉酸，不再需要被還原酶轉(zhuǎn)化，同時(shí)也避免了循環(huán)中的游離pmg，降低了藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)，且不會(huì)掩蓋維生素b2缺乏癥。5-mthf的制備方法包括化學(xué)法和生物法。化學(xué)法合成l-5-mthf工藝成熟，但生產(chǎn)過程中可能會(huì)造成生產(chǎn)安全問題和環(huán)境污染，還需手性拆分才能得到有生理活性的l-5-mthf，大大增加了生產(chǎn)成本。
3、二氫葉酸還原酶可以將葉酸還原為四氫葉酸，經(jīng)四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶(dmda)催化得到l-5-mthf，但受限于二氫葉酸還原酶的活性，四氫葉酸或者l-5-mthf的產(chǎn)量并不高。因此，如何對(duì)二氫葉酸還原酶進(jìn)行改造，提高其催化活性，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明提供一種具有二氫葉酸還原酶活性的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用，用于催化葉酸的還原反應(yīng)。
2、本發(fā)明第一方面提供一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自a1)-a2)中的至少一種：
3、a1)氨基酸序列為seq?id?no:1所示的蛋白質(zhì)；
4、a2)在a1)的n端和/或c端連接蛋白標(biāo)簽后得到的融合蛋白。
5、本發(fā)明第二方面提供編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子。
6、進(jìn)一步地，所述核酸分子選自b1)-b2)中的任一種：
7、b1)核苷酸序列是seq?id?no:2所示的dna分子；
8、b2)與b1)限定的dna分子有80％以上同一性且編碼具有相同蛋白質(zhì)的dna分子。
9、本發(fā)明第三方面提供包括上述核酸分子的重組表達(dá)載體。
10、本發(fā)明第四方面提供上述蛋白質(zhì)在作為二氫葉酸還原酶中的應(yīng)用。
11、本發(fā)明第五方面提供一種組合物，包括上述蛋白質(zhì)。
12、進(jìn)一步地，所述組合物可以是包括上述蛋白質(zhì)的粗酶液，比如收集表達(dá)上述蛋白質(zhì)的工程菌的菌體，對(duì)菌體進(jìn)行破裂后收集含有上述蛋白質(zhì)的粗酶液。
13、進(jìn)一步地，還包括葡萄糖脫氫酶和/或四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶。
14、進(jìn)一步地，所述葡萄糖脫氫酶選自c1)-c4)中的至少一種：
15、c1)氨基酸序列為seq?id?no:3的蛋白質(zhì)；
16、c2)將c1)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；
17、c3)與c1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)；
18、c4)在c1)-c3)任一所示的蛋白質(zhì)的羧基端和/或氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白。
19、進(jìn)一步地，所述四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶選自d1)-d4)中的至少一種：
20、d1)氨基酸序列為seq?id?no:4的蛋白質(zhì)；
21、d2)將d1)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶活性的蛋白質(zhì)；
22、d3)與d1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶活性的蛋白質(zhì)；
23、d4)在d1)-d3)任一所示的蛋白質(zhì)的羧基端和/或氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白。
24、本發(fā)明中，80％以上的同一性可為至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
25、進(jìn)一步地，所述組合物還可以包括催化四氫葉酸及其衍生物反應(yīng)所需的其他小分子化合物，例如，底物葉酸、氫供體、抗氧化劑、甲基供體等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇添加。
26、本發(fā)明第六方面提供一種工程菌，所述工程菌表達(dá)上述蛋白質(zhì)或者包括上述核酸分子或者包括上述重組表達(dá)載體。
27、本發(fā)明第七方面提供一種菌劑，包括上述工程菌。
28、進(jìn)一步地，所述菌劑還包括表達(dá)葡萄糖脫氫酶和/或四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶的工程菌。
29、本發(fā)明第八方面提供上述蛋白質(zhì)或者上述組合物或者上述工程菌或者上述菌劑在制備四氫葉酸或其衍生物中的應(yīng)用。
30、本發(fā)明第九方面提供一種制備四氫葉酸或其衍生物的方法，使用上述蛋白質(zhì)或者上述組合物或者上述工程菌或者上述菌劑催化葉酸進(jìn)行還原反應(yīng)得到四氫葉酸或其衍生物。
31、進(jìn)一步地，所述四氫葉酸衍生物包括l-5甲基四氫葉酸。
32、所涉及的化學(xué)反應(yīng)如下所示：
33、
34、進(jìn)一步地，上述制備過程還包括底物葉酸、氫供體和抗氧化劑。
35、進(jìn)一步地，所述氫供體可以為nadph，其與葉酸的摩爾比為1:0.005-1:2。進(jìn)一步地，所述nadph可以由nadp+接受葡萄糖脫下的氫轉(zhuǎn)化得到。
36、進(jìn)一步地，所述葡萄糖與葉酸的摩爾比為1:4-1:20。
37、進(jìn)一步地，抗氧化劑可以為抗壞血酸鈉、二硫蘇糖醇、2,3-二巰基-1-丙醇和2-硫代巴比妥酸中的至少一種，防止產(chǎn)物四氫葉酸氧化，其與葉酸的摩爾比為1:0.2-1:5。
38、進(jìn)一步地，在制備l-5甲基四氫葉酸的過程中，還包括加入甲基供體二甲基巰基丙酸(dmsp)。
39、本發(fā)明提供了一種新的二氫葉酸還原酶突變體，可高效催化葉酸轉(zhuǎn)化為l-四氫葉酸，同時(shí)加入葡萄糖脫氫酶建立nadph循環(huán)系統(tǒng)為二氫葉酸還原酶提供nadph，通過四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶將四氫葉酸轉(zhuǎn)化為l-5-甲基四氫葉酸。本發(fā)明提供的方法可解決了化學(xué)法生產(chǎn)5-甲基四氫葉酸產(chǎn)率低、存在環(huán)境污染和生物法反應(yīng)復(fù)雜、底物成本高的問題，大幅降低了生產(chǎn)5-甲基四氫葉酸的成本，提高了5-甲基四氫葉酸的合成效率與合成質(zhì)量，具有較好的產(chǎn)業(yè)化前景。
1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自a1)-a2)中的至少一種：
2.編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核酸分子。
3.包括權(quán)利要求2所述的核酸分子的重組表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)在作為二氫葉酸還原酶中的應(yīng)用。
5.組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，還包括葡萄糖脫氫酶和/或四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶。
7.一種工程菌，其特征在于，所述工程菌表達(dá)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或者包括權(quán)利要求2所述的核酸分子或者包括權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體。
8.菌劑，其特征在于，包括權(quán)利要求7所述的工程菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑還包括表達(dá)葡萄糖脫氫酶和/或四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶的工程菌。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或者權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的組合物或者權(quán)利要求7所述的工程菌或者權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的菌劑在制備四氫葉酸或其衍生物中的應(yīng)用。
11.一種制備四氫葉酸或其衍生物的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或者權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的組合物或者權(quán)利要求7所述的工程菌或者權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的菌劑催化葉酸進(jìn)行還原反應(yīng)得到四氫葉酸或其衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述四氫葉酸的衍生物包括l-5-甲基四氫葉酸。