本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液的配制、及使用這種培養(yǎng)液進(jìn)行nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法與所得nk細(xì)胞的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、腫瘤是困擾人類健康的重大疾病，但由于其高度的復(fù)雜性、多樣性、可變性和異質(zhì)性，一直找不到一種更加深入治療方法，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，癌癥的治愈率、生存率都有顯著的改善，但現(xiàn)在仍然是難治性的疾病。
2、腫瘤免疫治療被國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為第四大腫瘤治療法；其中，自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)，比如，nk細(xì)胞免疫治療正成為一種可靠的抗癌療法，適用于多種惡性腫瘤的臨床治療，且副作用小，不損傷正常組織。
3、自然殺傷（nk）細(xì)胞作為癌癥免疫療法的藥物方式是有效的，因?yàn)閚k細(xì)胞可以殺死各種腫瘤細(xì)胞，而無需故意免疫、激活或事先致敏。與t細(xì)胞不同，nk細(xì)胞缺乏表面t細(xì)胞受體（tcr），不會(huì)引起移植物抗宿主?。╣vhd），因此nk細(xì)胞具有同種異體療法的優(yōu)勢(shì)。
4、對(duì)于nk細(xì)胞在臨床上的同種異體療法應(yīng)用的關(guān)鍵是其純度和數(shù)量，研究表明，nk細(xì)胞的激活和增殖有多種途徑，包括細(xì)胞因子刺激、受體激活劑刺激和飼養(yǎng)細(xì)胞刺激，其中細(xì)胞因子刺激和受體激活劑刺激前期需要一定比例的其他淋巴細(xì)胞（如t淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等），往往因?yàn)閭€(gè)體差異導(dǎo)致其他淋巴細(xì)胞的比例不好把控和最終的nk純度參差不齊，而飼養(yǎng)細(xì)胞刺激會(huì)引發(fā)異樣細(xì)胞的殘留，給成品的質(zhì)控帶來一定挑戰(zhàn)。使用提純后nk細(xì)胞作為增殖起點(diǎn)能有效解決nk細(xì)胞培養(yǎng)純度低的問題，但是提純后nk細(xì)胞在一般培養(yǎng)條件下的增殖較為緩慢且增殖代次有限，且細(xì)胞耗竭高。
5、因此，探索高純度、高數(shù)量、安全穩(wěn)定且低耗竭的nk細(xì)胞培養(yǎng)液組分及培養(yǎng)工藝，是目前同種異體nk應(yīng)用所面臨的挑戰(zhàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于上述問題，本發(fā)明所要解決的問題在于提供一種能培養(yǎng)出純度高、安全可靠，且低耗竭nk細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)液，以及該培養(yǎng)液進(jìn)行nk細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的應(yīng)用。
2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
3、一種nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，該擴(kuò)增培養(yǎng)液中包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含終濃度1~500ug/ml多糖、終濃度50~2000u/ml?il-2、終濃度0.5~5%v/v?血小板裂解物、終濃度0.1~1%v/v獼猴梨根莖的濃縮提取物及終濃度0.1~1%v/v龍膽草根莖的濃縮提取物。
4、一實(shí)施例，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12、imdm或rpmi-1640培養(yǎng)基。
5、一實(shí)施例，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述多糖包括靈芝多糖、銀杏多糖、白及多糖及東方栓菌多糖中的一種或多種。
6、一實(shí)施例，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述獼猴梨根莖的濃縮提取物，采用如下工藝制備得到：
7、用去離子水浸泡洗凈的所述獼猴梨根莖30~60min；
8、取出浸泡后的所述獼猴梨根莖10~20g置于破壁機(jī)中，加入2~4℃去離子水，于5~10℃下攪碎，得到漿糊狀液體；其中，所述獼猴梨根莖與去離子水的質(zhì)量體積比為0.02~0.05g/ml；
9、過濾所述漿糊狀液體，將過濾得到的初濾液離心，離心結(jié)束后收集離心上清；
10、將收集到的所述離心上清進(jìn)行濃縮過濾，得到所述獼猴梨根莖的濃縮提取物。
11、一實(shí)施例，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述龍膽草根莖的濃縮提取物，采用如下工藝制備得到：
12、用去離子水浸泡洗凈的所述龍膽草根莖30~60min；
13、取出浸泡后的所述龍膽草根莖10~20g置于破壁機(jī)中，加入2~4℃去離子水，于5~10℃下攪碎，得到漿糊狀液體；其中，所述龍膽草根莖與去離子水的質(zhì)量體積比為0.02~0.05g/ml；
14、過濾所述漿糊狀液體，將過濾得到的初濾液離心，離心結(jié)束后收集離心上清；
15、將收集到的所述離心上清進(jìn)行濃縮過濾，得到所述龍膽草根莖的濃縮提取物。
16、一實(shí)施例，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)液中，對(duì)所述初濾液離心還包括如下處理：
17、首先，4℃下，采用3000g離心20min所述初濾液，收集上清液；
18、其次，4℃下，再將所述上清液10000g離心20min，收集并得到所述離心上清。
19、一實(shí)施例，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)液中，將所述離心上清進(jìn)行濃縮過濾，還包括如下處理：
20、使用0.22μm孔徑濾膜對(duì)收集到的所述離心上清進(jìn)行過濾，收集濾液；
21、將收集到的濾液通過300kd孔徑的中空纖維柱，進(jìn)行循環(huán)回流濃縮過濾，待回流濾液濃縮至10ml體積時(shí)，收集并得到回流的濃縮提取物；該濃縮提取物的工作濃度為1ml/l。
22、本發(fā)明還使用上述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行nk細(xì)胞培養(yǎng)，包括如下步驟：
23、第0天，取20ml上述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液重懸1.0~4.0×107個(gè)nk細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至tc175培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
24、第3天，往培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充添加所述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，且維持培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度為0.5~1.0×106個(gè)/ml,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
25、第5天，將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至10l規(guī)格的培養(yǎng)袋，往培養(yǎng)袋中補(bǔ)充添加所述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，且維持培養(yǎng)袋中細(xì)胞密度為0.5~1.0×106個(gè)/ml,將培養(yǎng)袋置于搖床中培養(yǎng)；
26、第7至15天，每隔兩天補(bǔ)充添加所述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，并維持細(xì)胞密度為1.0~2.0×106個(gè)/ml,繼續(xù)置于搖床中培養(yǎng)；
27、第17至24天，每隔兩天補(bǔ)充添加所述nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，并維持細(xì)胞密度為2.0~3.0×106個(gè)/ml,繼續(xù)置于搖床中培養(yǎng);
28、第24天，停止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)袋中的細(xì)胞及培養(yǎng)液，離心后用pbs反復(fù)洗滌多次細(xì)胞沉淀，獲得高純度、高活性的nk細(xì)胞。
29、通過上述培養(yǎng)方法制得的nk細(xì)胞，可以被應(yīng)用于制備預(yù)防、治療腫瘤或癌癥藥物。
30、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明提供的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其獼猴梨根莖和龍膽草根莖的濃縮提取物組分，能維持nk細(xì)胞的活性，減緩細(xì)胞衰老，保持生理活性更穩(wěn)定持久，促進(jìn)細(xì)胞因子（,如tnf-α、il-1β、il-6、fasl）的分泌，導(dǎo)致因子分泌水平正常甚至能更高；還可降低細(xì)胞耗竭，保持長周期（24天以上）的細(xì)胞增殖；同時(shí)，本發(fā)明nk細(xì)胞培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)工藝簡單、無需包被、操作方便。
1.一種nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其特征在于，該擴(kuò)增培養(yǎng)液中包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含終濃度1~500ug/ml多糖、終濃度50~2000u/ml?il-2、終濃度0.5~5%v/v血小板裂解物、終濃度0.1~1%v/v獼猴梨根莖的濃縮提取物及終濃度0.1~1%v/v龍膽草根莖的濃縮提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12、imdm或rpmi-1640培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其特征在于，所述多糖包括靈芝多糖、銀杏多糖、白及多糖及東方栓菌多糖中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其特征在于，所述獼猴梨根莖的濃縮提取物，采用如下工藝制備得到：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其特征在于，所述龍膽草根莖的濃縮提取物，采用如下工藝制備得到：
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其特征在于，對(duì)所述初濾液離心還包括如下處理：
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液，其特征在于，將所述離心上清進(jìn)行濃縮過濾，還包括如下處理：
8.一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.一種如權(quán)利要求8所述培養(yǎng)方法制得的nk細(xì)胞在制備預(yù)防、治療腫瘤或癌癥藥物方面的應(yīng)用。