本發(fā)明涉及生物合成及分離，具體涉及一種mrna體外合成和分離富集的方法。
背景技術(shù)：
1、以信使rna（messenger?rna，mrna）為主的核酸疫苗近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了顯著的進展。mrna技術(shù)的迅速發(fā)展得益于其合成的可控性、生產(chǎn)工藝的標準化及其良好的安全性和有效性。從分子設(shè)計來看，mrna的設(shè)計靈活，可以根據(jù)病原體變異的需求快速定制化，廣泛編碼和表達各種類型的蛋白質(zhì)，從而適應(yīng)不同的治療需求。從生產(chǎn)過程來看，mrna是一種無細胞制備的分子，不依賴于細胞培養(yǎng)，大大簡化了生產(chǎn)過程；再者，mrna的生產(chǎn)周期相對較短，能夠在緊急情況下快速擴展產(chǎn)能，適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)的需求。從體內(nèi)安全性和有效性來看，mrna不使用病毒載體，不改變宿主基因組，具有良好的免疫原性和高特異性。以上優(yōu)勢使其在應(yīng)對新的流行病毒或突發(fā)疫情方面具有巨大的潛力和吸引力。
2、mrna的合成主要依賴于體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，通常以包含啟動子序列（如t7啟動子）、編碼序列和poly(a)尾的dna序列為模板，在rna聚合酶的催化下以四種三磷酸核苷分子為原料合成mrna。合成后的mrna需要進行分離純化，以去除相關(guān)雜質(zhì)，如dna模板、未反應(yīng)的核苷酸、不完全轉(zhuǎn)錄的短轉(zhuǎn)錄本、酶等。由于各雜質(zhì)組分的性質(zhì)差異，往往需要多種分離方法聯(lián)用。大多數(shù)mrna分離純化工藝主要依賴于柱層析分離，而柱層析分離過程通常伴隨mrna洗脫液的稀釋，因此通常與切向流過濾組合以獲得高濃度的mrna，從而需繼續(xù)進行后續(xù)步驟。每增加一個分離步驟，不但設(shè)備成本增加，mrna產(chǎn)量也會有所損耗。
3、以傳統(tǒng)的mrna分離為例，首先通過加入dna酶去除dna模板（此步驟可省略），之后通過切向流過濾去除部分未反應(yīng)的核苷酸、不完全轉(zhuǎn)錄的短轉(zhuǎn)錄本、酶等，再通過poly-dt親和層析介質(zhì)特異性捕獲含poly(a)尾的目標mrna并洗脫，最后通過離子對反相高效液相色譜去除相關(guān)的雙鏈rna雜質(zhì)，并通過切向流過濾進行富集。對于共轉(zhuǎn)錄加帽體系而言，以上分離可獲得純化的加帽mrna；而對于普通轉(zhuǎn)錄的酶法加帽體系而言，上述poly-dt親和層析洗脫獲得的mrna經(jīng)過切向流過濾富集之后還需要添加加帽酶和底物繼續(xù)進行加帽反應(yīng)，之后需要重復(fù)上述操作，延長了mrna的工藝流程，并容易導(dǎo)致mrna的降解和收率的降低。無論是共轉(zhuǎn)錄加帽體系還是普通轉(zhuǎn)錄的酶法加帽體系，尋找合適的方法實現(xiàn)mrna合成、分離、富集的耦合對于生產(chǎn)成本的降低都有著至關(guān)重要的作用。
4、pascolo等（methods?mol?med,?2006,?127,?23.）報道了通過氯化鋰沉淀純化mrna的方法，但該方法耗時長，往往需要過夜沉淀，難以在工業(yè)生產(chǎn)中放大，且無法獲得高純度的mrna。us11274293b2公開了一種合成并純化rna的方法，該方法通過體外轉(zhuǎn)錄合成mrna，之后經(jīng)多步切向流過濾獲得純化的mrna。盡管實驗表明切向流過濾中的剪切力對mrna的穩(wěn)定性無負面影響，但反復(fù)的切向流過濾容易導(dǎo)致mrna吸附在分離膜表面，造成損失。au2018224318b2公開了一種rna的純化方法，該方法在裝有多孔基底的離心機中離心mrna懸浮液，使離心速度足以去除加工過程中的污染物，同時純化的mrna成分可以沉淀到多孔基底上。然而，該方法同樣僅針對mrna的分離及富集過程。因此，如何借助雙水相體系的優(yōu)勢開發(fā)一種同時實現(xiàn)mrna體外合成和分離富集的技術(shù)對mrna的工藝集成具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種mrna體外合成和分離富集的方法，以提供一種mrna體外合成、分離、富集三合一的集成技術(shù)，從而縮短mrna新型生產(chǎn)工藝的流程及時間。
2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種mrna體外合成和分離富集的方法，包括以下步驟：
3、（1）將聚乙二醇和葡聚糖混合，形成初始雙水相體系；
4、（2）將步驟（1）所得的初始雙水相體系經(jīng)過離心分離，分別收集上層的聚乙二醇富集相和下層的葡聚糖富集相，混合后形成復(fù)合聚乙二醇/葡聚糖雙水相體系；復(fù)合聚乙二醇/葡聚糖雙水相體系中聚乙二醇富集相和葡聚糖富集相的體積比為5-10:1；
5、（3）向步驟（2）的復(fù)合聚乙二醇/葡聚糖雙水相體系中加入轉(zhuǎn)錄試劑，制得雙水相體外轉(zhuǎn)錄體系；
6、（4）將步驟（3）所得的雙水相體外轉(zhuǎn)錄體系進行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)過程中對該體系進行混合，反應(yīng)結(jié)束后將兩相分離。
7、進一步，步驟（1）中聚乙二醇和葡聚糖的分子量分別為8000和20000-70000；聚乙二醇和葡聚糖的濃度分別為30-40%和5-20%。
8、進一步，步驟（3）中轉(zhuǎn)錄試劑為非加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑或加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑。
9、進一步，非加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑包括轉(zhuǎn)錄緩沖液、四種三磷酸核苷、rna酶抑制劑、dna模板和rna聚合酶。
10、進一步，轉(zhuǎn)錄緩沖液為tris-鹽酸溶液和氯化鎂溶液。
11、進一步，加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑包括轉(zhuǎn)錄緩沖液、四種三磷酸核苷、加帽類似物、rna酶抑制劑、dna模板和rna聚合酶。
12、進一步，轉(zhuǎn)錄緩沖液為tris-鹽酸溶液和氯化鎂溶液；加帽類似物為cap-ag加帽類似物。
13、進一步，步驟（4）中轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的時間為3-4h。
14、本發(fā)明具有以下有益效果：
15、（1）本發(fā)明建立了一種基于雙水相體系的mrna體外合成、分離、富集三合一的集成技術(shù)。針對mrna的體外合成與分離富集長期以來的多步驟流程，本發(fā)明將mrna體外合成反應(yīng)和雙水相體系結(jié)合，利用雙水相體系自發(fā)相分離的優(yōu)勢實現(xiàn)mrna合成、分離、富集的一鍋耦合集成，無需對中間產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)移和處理，縮短了mrna的工藝流程及時間，在mrna工藝耦合集成中具有廣泛的應(yīng)用前景。
16、（2）在雙水相反應(yīng)體系中，mrna以及合成mrna的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物全部自發(fā)分配于葡聚糖反應(yīng)富集相中，實際上提高了各反應(yīng)組分的濃度，增加了底物、酶、dna模板的接觸面積；同時，間歇混合過程促進了兩相組分的重新分配，新的反應(yīng)組分重新進入葡聚糖反應(yīng)富集相中形成新的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，加快了mrna的合成速率。
17、（3）本發(fā)明提供的mrna體外合成及分離富集的集成技術(shù)無需使用層析介質(zhì)及超濾濃縮裝置即可實現(xiàn)mrna和其他反應(yīng)底物的初步分離，降低了相應(yīng)的設(shè)備及材料成本。
18、（4）本申請?zhí)峁┑膍rna體外合成及分離富集的集成技術(shù)對于含有cap-ag加帽類似物的共轉(zhuǎn)錄體系同樣適用，進一步縮短了加帽mrna的工藝流程及時間。
1.一種mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，步驟（1）中所述聚乙二醇和葡聚糖的分子量分別為8000和20000-70000；所述聚乙二醇和葡聚糖的濃度分別為30-40%和5-20%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，步驟（3）中所述轉(zhuǎn)錄試劑為非加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑或加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，所述非加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑包括轉(zhuǎn)錄緩沖液、四種三磷酸核苷、rna酶抑制劑、dna模板和rna聚合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄緩沖液為tris-鹽酸溶液和氯化鎂溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，所述加帽mrna轉(zhuǎn)錄試劑包括轉(zhuǎn)錄緩沖液、四種三磷酸核苷、加帽類似物、rna酶抑制劑、dna模板和rna聚合酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄緩沖液為tris-鹽酸溶液和氯化鎂溶液；所述加帽類似物為cap-ag加帽類似物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mrna體外合成和分離富集的方法，其特征在于，步驟（4）中所述轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的時間為3-4h。