本申請(qǐng)涉及植物基因工程，具體涉及 vvbhlh35基因及其增強(qiáng)葡萄耐鹽性的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、葡萄（ vitis?vinifera?l.）是我國(guó)四大果樹(shù)之一，成熟的果實(shí)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和加工屬性進(jìn)而創(chuàng)造了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。在葡萄栽培中，由于高鹽度地下水的增加、不合理的灌溉方式以及氣候變化導(dǎo)致的土壤蒸發(fā)量的增加進(jìn)而引起土壤鹽漬化（rengasamyet?al.，2006）。土壤中鹽分過(guò)高會(huì)引起葡萄植株的缺水和營(yíng)養(yǎng)失衡、滲透脅迫和離子脅迫、氧化脅迫等生理生化水平的應(yīng)激（zhu?et?al.，2002），甚至影響果實(shí)品質(zhì)形成。
2、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bhlh）轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)逆境脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位。研究結(jié)果表明，在鹽脅迫下， bhlh123激活了參與鹽耐受性調(diào)控的基因，并提高了超氧化物歧化酶（sod）和過(guò)氧化物酶（pod）這兩種參與清除ros的主要抗氧化酶的水平（liu?et?al.,?2021）。此外，還發(fā)現(xiàn) pagbhlh35在楊樹(shù)中過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致ros積累減少和mda含量降低（wang?et?al.,2024）。在水稻中， osbhlh35通過(guò)調(diào)控花藥發(fā)育來(lái)影響水稻產(chǎn)量。在水稻中過(guò)表達(dá) osbhlh035植株能夠抑制 osaba2和 osaao3基因的表達(dá)來(lái)減少aba合成，促進(jìn) osaba8ox1的表達(dá)來(lái)提高aba分解代謝，減輕鹽脅迫下aba對(duì)發(fā)芽抑制的作用（chen?et?al.,2018）。 atbhlh35通過(guò)增大氣孔密度、減小氣孔孔徑、降低蒸發(fā)率和水分流失、增加葉綠素含量以及提高光合作用率來(lái)提高植物的抗旱性（jiang?et?al.,?2019）。綜上所述， bhlh35在緩解葡萄植株鹽堿脅迫方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明要解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題在于提供 vvbhlh35基因調(diào)控葡萄耐鹽性方面的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
2、1.過(guò)表達(dá)葡萄vvbhlh35基因在增強(qiáng)葡萄耐鹽性的應(yīng)用，所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
3、2.過(guò)表達(dá)vvbhlh35基因增強(qiáng)葡萄鹽脅迫下抗氧化酶活力的應(yīng)用，所述增強(qiáng)葡萄鹽脅迫下抗氧化酶活力通過(guò)提高pod、sod和cat酶活力，降低mda生成來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
4、3.過(guò)表達(dá)vvbhlh35基因提高葡萄鹽脅迫下類黃酮含量的應(yīng)用，所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
5、4.葡萄vvbhlh35蛋白增強(qiáng)葡萄耐鹽性的應(yīng)用，所述蛋白的氨基酸序列如seq?idno.2所示。
6、5.?葡萄 vvbhlh35基因植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建方法，所述方法包括：葡萄的cdna中pcr得到全長(zhǎng)編碼序列，其中，過(guò)表達(dá) vvbhlh35所用序列為序列表seq?id?no.1所示，過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建所用pcr引物為正向引物：?5'?-agaacacgggggacgagctcatggacaacacagaggagttc-3'?;?反向引物：?5'?-ctagaggatccccgggtacctatactcataggactctgtggatc?-3'?；將上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收。對(duì)過(guò)表達(dá)載體，利用同源重組酶將膠回收全長(zhǎng) vvbhlh35基因編碼區(qū)片段重組到pcambia2300-egfp表達(dá)載體；將連接后的過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，pcr檢測(cè)陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證；測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，pcr檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行保存，用于進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化。
7、6.?葡萄 vvbhlh35基因調(diào)控葡萄耐鹽性的應(yīng)用驗(yàn)證方法，所述方法包括：（1）模式植物擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，（2）葡萄愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化（3）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥株系及愈傷的檢測(cè)，（4）擬南芥株系及愈傷耐鹽性測(cè)定。
8、7.?葡萄 vvbhlh35基因調(diào)控葡萄耐鹽性方面的應(yīng)用，所述應(yīng)用通過(guò)過(guò)表達(dá)上調(diào) vvbhlh35基因表達(dá)予以實(shí)現(xiàn)。
9、8.?過(guò)表達(dá) vvbhlh35基因在提高葡萄耐鹽性方面的應(yīng)用，所述葡萄 vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
10、有益效果：本發(fā)明通過(guò)過(guò)表達(dá)葡萄vvbhlh35基因（seq?id?no.1）顯著提高了葡萄的耐鹽性。具體表現(xiàn)為：顯著增強(qiáng)鹽脅迫下pod、sod和cat等抗氧化酶活性，有效降低mda積累，減輕氧化損傷；顯著提高類黃酮含量，進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗氧化防御能力。本發(fā)明為作物耐鹽遺傳改良提供了新的基因資源和技術(shù)方案，在鹽堿地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。
1.過(guò)表達(dá)葡萄vvbhlh35基因在增強(qiáng)葡萄耐鹽性的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
2.過(guò)表達(dá)vvbhlh35基因增強(qiáng)葡萄鹽脅迫下抗氧化酶活力的應(yīng)用，其特征在于所述增強(qiáng)葡萄鹽脅迫下抗氧化酶活力通過(guò)提高pod、sod和cat酶活力，降低mda生成來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
3.過(guò)表達(dá)vvbhlh35基因提高葡萄鹽脅迫下類黃酮含量的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。
4.葡萄vvbhlh35蛋白增強(qiáng)葡萄耐鹽性的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
5.?葡萄vvbhlh35基因植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括：葡萄的cdna中pcr得到全長(zhǎng)編碼序列，其中，過(guò)表達(dá)vvbhlh35所用序列為序列表seq?id?no.1所示，過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建所用pcr引物為正向引物：?5'?-agaacacgggggacgagctcatggacaacacagaggagttc-3'?;?反向引物：?5'?-ctagaggatccccgggtacctatactcataggactctgtggatc?-3'?；將上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收；對(duì)過(guò)表達(dá)載體，利用同源重組酶將膠回收全長(zhǎng)vvbhlh35基因編碼區(qū)片段重組到pcambia2300-egfp表達(dá)載體；將連接后的過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，pcr檢測(cè)陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證；測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，pcr檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行保存，用于進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化。
6.葡萄vvbhlh35基因調(diào)控葡萄耐鹽性的應(yīng)用驗(yàn)證方法，其特征在于所述方法包括：（1）模式植物擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，（2）葡萄愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化（3）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥株系及愈傷的檢測(cè)，（4）擬南芥株系及愈傷耐鹽性測(cè)定。
7.葡萄vvbhlh35基因調(diào)控葡萄耐鹽性方面的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用通過(guò)過(guò)表達(dá)上調(diào)vvbhlh35基因表達(dá)予以實(shí)現(xiàn)。
8.?過(guò)表達(dá)vvbhlh35基因在提高葡萄耐鹽性方面的應(yīng)用，其特征在于所述葡萄vvbhlh35基因cds序列如序列表seq?id?no.1所示。