本發(fā)明涉及基因檢測(cè)，尤其涉及一種基于rpa-pfago檢測(cè)方法的惡性瘧原蟲檢測(cè)組合物、試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、瘧疾(malaria)是一種由瘧原蟲引起的嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病，與艾滋病、結(jié)核一起被列為全球三大公共衛(wèi)生問題。惡性瘧原蟲(plasmodiumfalciparum，pf)是最致命的瘧疾寄生蟲，在非洲大陸上最為流行。如不及時(shí)診斷并加以治療，惡性瘧原蟲瘧疾可能在24小時(shí)內(nèi)發(fā)展成重癥瘧疾，甚至造成死亡據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)統(tǒng)計(jì)，2023年全球報(bào)告2.63億瘧疾病例和59.7萬例死亡，其中非洲地區(qū)負(fù)擔(dān)最重。該地區(qū)病例數(shù)(2.46億)和死亡數(shù)(56.9萬)分別占全球總量的94％和95％，五歲以下兒童占非洲瘧疾死亡病例的76％。值得注意的是，瘧疾在赤道幾內(nèi)亞仍是重大公共衛(wèi)生問題，2021年位列該國(guó)五大死因之一，全國(guó)感染率達(dá)23.5％。這些數(shù)據(jù)表明，亟需針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群采取精準(zhǔn)干預(yù)措施以降低傳播和死亡率，而惡性瘧原蟲的早期鑒別診斷以及及時(shí)、準(zhǔn)確的治療是瘧疾防治中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2、目前，血涂片瘧原蟲顯微鏡檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase?chain?reaction，pcr)是瘧疾診斷的常用方法。然而，瘧疾診治的一大難題在于，許多需要進(jìn)行惡性瘧原蟲蟲種鑒定及瘧疾耐藥基因分型的高風(fēng)險(xiǎn)群體居住在落后的偏遠(yuǎn)地區(qū)，這些地方往往缺乏醫(yī)療支持，或者當(dāng)?shù)氐尼t(yī)療機(jī)構(gòu)難以提供充足的醫(yī)療資源。，以上方法由于專業(yè)依賴性強(qiáng)、耗時(shí)、需要大型且昂貴的儀器等原因，不能滿足即時(shí)檢測(cè)(point-of-care?testing，poct)的需求。

3、在這種背景下，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)(poct)顯得尤為重要：它能夠在患者身邊直接進(jìn)行，無需依賴專業(yè)設(shè)備，也無需復(fù)雜的技術(shù)培訓(xùn)，從而實(shí)現(xiàn)快速、便捷的即時(shí)檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated?isothermal?amplification，lamp)、重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增(recombinase?polymerase?amplification，rpa)等恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的開發(fā)為poct的實(shí)現(xiàn)創(chuàng)造了可能。它們不需要熱循環(huán)過程，從而大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，并加快了核酸擴(kuò)增的速度。lamp是一種在等溫條件下(60℃-65℃)擴(kuò)增的，具有快速高效以及高度敏感性的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。然而，lamp引物設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，其對(duì)靶序列的高要求使其不具有普遍適用性，尤其是像瘧疾一樣具有超高的a、t核苷酸比例的較短的靶標(biāo)序列。此外，lamp的超高敏感性導(dǎo)致的開蓋污染問題也令人望而生畏。rpa/raa是目前被最普遍使用的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在35℃-42℃的條件下，只需反應(yīng)30分鐘，就能獲得良好的擴(kuò)增產(chǎn)物，且能展現(xiàn)出較高的靈敏度。crispr/cas系統(tǒng)、argonaute等基因編輯酶的出現(xiàn)也為poct的發(fā)展引入了新的靈感，它們都在體外具有核酸酶活性，能夠通過核苷酸的識(shí)別進(jìn)行特異性的剪切，從而實(shí)現(xiàn)分子檢測(cè)。然而，目前基于crispr/cas系統(tǒng)或argonaute的技術(shù)還不具備能直接對(duì)生物樣本內(nèi)提取出的超低含量的核酸直接進(jìn)行檢測(cè)的超高靈敏度，而需要借助核酸擴(kuò)增才能達(dá)到其檢測(cè)要求。

4、因此，迫切需要開發(fā)出既具有高靈敏度又無需昂貴設(shè)備支持的、成本更低的惡性瘧原蟲診斷技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于rpa-pfago檢測(cè)方法的惡性瘧原蟲檢測(cè)組合物、試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用，該方法檢測(cè)的特異性強(qiáng)，靈敏度高，可在60分鐘內(nèi)完成，提高了檢測(cè)效率，使檢測(cè)結(jié)果直觀易讀，順應(yīng)了快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，開發(fā)出了適用于資源有限環(huán)境的檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)于瘧疾的防控具有重要意義。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種基于rpa-pfago檢測(cè)方法的惡性瘧原蟲檢測(cè)組合物，所述組合物包括以下序列：

4、rpa上游引物-seq?id?no.3：attaagtgttcataacagacgggtagtcat；

5、rpa下游引物-seq?id?no.4：cctctgacatctgaatacgaatgcccccaaa；

6、探針-seq?id?no.11：fam-ttttgatattcttattagcttagtt-bhq1；

7、gdna1-seq?id?no.15：p-ctagcttagttacgat；

8、gdna2-seq?id?no.14：p-ctttttgatattctta。

9、本發(fā)明還提供了一種上述基于rpa-pfago檢測(cè)方法的惡性瘧原蟲檢測(cè)組合物在惡性瘧原蟲檢測(cè)上的應(yīng)用。

10、本發(fā)明還提供了一種基于rpa-pfago檢測(cè)方法的惡性瘧原蟲檢測(cè)試劑盒，所述惡性瘧原蟲檢測(cè)試劑盒包括上述基于rpa-pfago檢測(cè)方法的惡性瘧原蟲檢測(cè)組合物。

11、本發(fā)明還提供了一種上述惡性瘧原蟲檢測(cè)試劑盒在惡性瘧原蟲檢測(cè)上的應(yīng)用。

12、本發(fā)明還提供了一種基于rpa-pfago的惡性瘧原蟲可視化檢測(cè)方法，包括如下步驟：

13、(1)rpa反應(yīng)：

14、制備rpa反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系置于37～42℃下孵育20～40min；

15、(2)pfago反應(yīng)

16、制備pfago反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系置于95℃反應(yīng)20～40min。

17、優(yōu)選的，在步驟(1)中，所述rpa反應(yīng)體系包括如下成分：

18、29～30μlabuffer、2～5μl乙酸鎂、2～3μl正向引物、2～3μl反向引物、4～6μl基因組dna。

19、優(yōu)選的，在步驟(2)中，所述pfago反應(yīng)體系包括如下成分：

20、10×buffer?2～4μl、40mm?mn2+1～6μl、10μm?gdna11～3μl、10μm?gdna21～3μl、200u/μlpfago?2～6μl、10μm?reporter?0.5～1.5μl、dna?amplification?product?2～6μl。

21、優(yōu)選的，所述可視化包括基于熒光讀取器讀取熒光曲線的熒光檢測(cè)法或通過紫外燈輔助觀察熒光管信號(hào)的裸眼觀察法。

22、本發(fā)明還提供了一種上述基于rpa-pfago的惡性瘧原蟲檢測(cè)方法在惡性瘧原蟲檢測(cè)上的應(yīng)用。

23、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果為：

24、(1)本發(fā)明將核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)rpa和pfago技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出一種強(qiáng)健、快速且高精確度的基于rpa-pfago的惡性瘧原蟲可視化檢測(cè)方法用于惡性瘧原蟲的檢測(cè)，該方法充分融合了基因編輯酶pfago技術(shù)的高特異性核酸切割能力和核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的等溫快速擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)。pfago技術(shù)使用更為穩(wěn)定的dna作為向?qū)?，而不是rna，通過短dna引導(dǎo)鏈將pfago引導(dǎo)到目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行高溫下的裂解，能夠識(shí)別和切割幾乎任何任意位點(diǎn)的dna序列，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)核酸的高效檢測(cè)，拓展了基因編輯pfago技術(shù)在生物傳感平臺(tái)構(gòu)建中的應(yīng)用范圍，檢測(cè)的特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1×102copies/μl的水平，能夠檢測(cè)到極低濃度的目標(biāo)核酸。并且檢測(cè)方法用時(shí)短，可在60分鐘內(nèi)完成，提高檢測(cè)效率，使檢測(cè)結(jié)果直觀易讀，順應(yīng)快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)，開發(fā)出適用于資源有限環(huán)境的檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)于瘧疾的防控具有重要意義，推動(dòng)核酸檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展。

25、(2)本發(fā)明將核酸的等溫?cái)U(kuò)增rpa技術(shù)與pfago檢測(cè)技術(shù)整合至單管反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)惡性瘧原蟲(p.falciparum)的高靈敏、高特異且快速的檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，無需復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)人員，適合在資源有限的現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中快速檢測(cè)。本發(fā)明基于rpa-pfago檢測(cè)方法開發(fā)的fbda(基于熒光讀取器讀取熒光曲線的熒光檢測(cè)法)與neo(通過紫外燈輔助觀察熒光管信號(hào)的裸眼觀察法)兩種可視化方法，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)門檻。與金標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡(lm)檢查方法相比，本發(fā)明一致性非常好，rpa-pfago?fbda法的正確率為98.08％，敏感性為96.15％，特異性為100％，kappa值為0.962；rpa-pfago?neo法的正確率為93.27％，敏感性為92.13％，特異性為94.23％，kappa值為0.865，在惡性瘧原蟲感染的識(shí)別與監(jiān)測(cè)，和資源有限的臨床環(huán)境中具有良好的應(yīng)用前景，對(duì)于瘧疾的防控，提升全球公共衛(wèi)生治理的科學(xué)性和有效性具有重要意義，為應(yīng)對(duì)全球性公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)提供了有力支持，更好地保護(hù)人類健康。