本發(fā)明涉及作物分子遺傳標(biāo)記，具體涉及一種皮燕麥的indel分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、分子標(biāo)記可通過dna序列多態(tài)性直接反映遺傳差異，較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)記具有顯著優(yōu)勢：（1）不受發(fā)育階段和環(huán)境干擾；（2）檢測通量高、重復(fù)性好；（3）可覆蓋全基因組變異?；谛乱淮鷾y序技術(shù)發(fā)展的indel標(biāo)記，兼具高多態(tài)性和強(qiáng)穩(wěn)定性特點(diǎn)：其插入/缺失變異在基因組中分布密集，且在不同遺傳背景下表現(xiàn)穩(wěn)定，已成為作物遺傳研究的核心工具，在重要性狀定位和分子育種中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來新一代測序技術(shù)的發(fā)展，在廣泛重測序或簡化基因組測序中獲得了大量植物品種資源的遺傳數(shù)據(jù)，并推動了全基因組插入/缺失長度多態(tài)性標(biāo)記的挖掘以及品種間遺傳差異精確解析工作。indel分子標(biāo)記屬于第三代分子標(biāo)記。相較于rflp、rapd、aflp、ssr等傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，具有高多態(tài)性：覆蓋全基因組，分布密集，涵蓋編碼和非編碼區(qū)；不同個體存在顯著差異。強(qiáng)穩(wěn)定性：不易發(fā)生變異，在多代遺傳和不同環(huán)境下可靠性高，重復(fù)性高，結(jié)果直觀。因此，indel分子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助育種，重要性狀的精準(zhǔn)定位等方面擁有廣泛的應(yīng)用潛力。

2、燕麥的皮裸性狀是其重要的農(nóng)藝性狀之一，對種子的品質(zhì)、產(chǎn)量及加工方式等具有重要影響。燕麥中皮燕麥和裸燕麥的區(qū)別主要在于成熟后籽粒外的谷殼是否容易跟籽粒分離，皮燕麥成熟后籽粒帶殼，其外稃為革質(zhì)，質(zhì)地堅硬，緊貼穎果；而裸燕麥成熟后籽粒不帶殼，其外稃為膜質(zhì)，質(zhì)地柔軟，容易跟穎果分離。目前，對皮/裸燕麥的鑒別主要依賴傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，即通過觀察燕麥籽粒的外觀特征（籽粒帶稃與否、小穗結(jié)構(gòu)等）來判斷，但皮/裸燕麥的形態(tài)特征在苗期和營養(yǎng)生長階段的差異并不明顯，需待成熟期才能將二者準(zhǔn)確區(qū)分，鑒定周期長達(dá)數(shù)月，常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定方法難以實(shí)現(xiàn)早期快速鑒別，嚴(yán)重制約育種效率和種子質(zhì)量檢測。并且僅依賴形態(tài)學(xué)的觀察容易受到觀察者經(jīng)驗(yàn)和主觀因素的影響，特別是當(dāng)籽粒外觀特征不明顯時，容易產(chǎn)生誤判。其次，形態(tài)學(xué)觀察需要逐粒檢查，耗時費(fèi)力，特別是在大規(guī)模育種和品種鑒定中，效率較低。因此，開發(fā)一種高效、準(zhǔn)確、操作簡便的皮/裸燕麥鑒別方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種皮燕麥的indel分子標(biāo)記及應(yīng)用，旨在利用indel分子標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對皮/裸燕麥的快速準(zhǔn)確鑒別，建立快速、準(zhǔn)確的基因型鑒定體系，對于提升種質(zhì)資源管理效率、保障種子質(zhì)量安全、加速燕麥遺傳改良進(jìn)程具有重要的理論價值和應(yīng)用前景。本發(fā)明可以推動燕麥育種從傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｊ较颥F(xiàn)代分子設(shè)計育種的轉(zhuǎn)型升級。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種皮燕麥的indel分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為一組位于皮燕麥品種?ot3098參考基因組oat_ot3098_v2（ncbi?assembly?gca_022788535.1）5c染色體位置610439484-610440026區(qū)間中314bp的缺失變異和2bp的插入變異，所述缺失序列如seq?id?no.1所示，所述插入序列為5’-aa-3’。

4、本發(fā)明基于全基因組重測序技術(shù)，在對皮燕麥與裸燕麥代表性樣本進(jìn)行序列比對和變異位點(diǎn)分析的基礎(chǔ)上，成功篩選出一個能夠顯著區(qū)分皮/裸燕麥的indel分子標(biāo)記位點(diǎn)區(qū)間，所述位點(diǎn)區(qū)間為位于皮燕麥品種?ot3098參考基因組oat_ot3098_v2（ncbi?assemblygca_022788535.1）5c染色體610439484-610440026區(qū)間，根據(jù)該位點(diǎn)區(qū)間設(shè)計indel分子標(biāo)記，將其命名為oa-indel-133，所述分子標(biāo)記oa-indel-133包括314bp的缺失變異（核苷酸序列如seq?id?no.1所示）和2bp的插入變異（核苷酸序列為5’-aa-3”），在皮燕麥與裸燕麥之間存在穩(wěn)定的312?bp長度片段差異。

5、進(jìn)一步的，本發(fā)明基于所述indel分子標(biāo)記位點(diǎn)區(qū)間設(shè)計了一對特異性引物（正向引物f:5'-caacttaacttctatgttgac-3'（seq?id?no.2），反向引物r:5'-caaactagcttttctaacaa-3'（seq?id?no.3）），通過優(yōu)化pcr反應(yīng)體系和降落擴(kuò)增程序可在皮燕麥中穩(wěn)定擴(kuò)增出一條231?bp的特異性條帶，而裸燕麥在該引物下則擴(kuò)增出543?bp的主帶或者無擴(kuò)增產(chǎn)物（不存在231?bp的特異性主條帶）。

6、第二方面，本發(fā)明提供了所述indel分子標(biāo)記的檢測方法，所述檢測方法是使用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所述分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)231bp條帶。

7、進(jìn)一步的，所述231bp條帶的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，其中，y/s/r/m/k為不保守堿基位點(diǎn)。

8、進(jìn)一步的，所述pcr擴(kuò)增的pcr體系為每20μl包含dna模板0.2～1.0?μl、2×taqmaster?mix?10?μl、權(quán)利要求2所述的正向引物1?μl、權(quán)利要求2所述的反向向引物1?μl，余量為ddh2o。

9、進(jìn)一步的，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)榻德涫絧cr程序，程序反應(yīng)條件為：94~95℃預(yù)變性3~5min；隨后進(jìn)行兩階段循環(huán)：第一階段為94~95?℃變性15~40?s、55~62℃退火15~40?s、72?℃延伸15~40?s，共6~12個循環(huán)；第二階段為94~95?℃變性15~40?s、50~55℃退火15~40s、72?℃延伸15~40?s，共25~35個循環(huán)；最后在72?℃延伸5?min，4?℃保存。

10、第三方面，本發(fā)明請求保護(hù)所述indel分子標(biāo)記或其檢測方法在燕麥種質(zhì)資源鑒別中的應(yīng)用。

11、進(jìn)一步的，所述燕麥種質(zhì)資源鑒別的方法為提取待測物的基因組dna為模板，使用本發(fā)明提供的特異性引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增和電泳鑒定獲得擴(kuò)增電泳結(jié)果，電泳泳道中呈現(xiàn)200～300bp條帶的為皮燕麥，呈現(xiàn)5?00～600bp條帶或無特征性條帶顯示的為裸燕麥。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所述indel分子標(biāo)記在48份測試樣本（詳見表1：包括23個裸燕麥品種、25個皮燕麥品種）中表現(xiàn)出良好的特異性和穩(wěn)定性，具有良好的種間區(qū)分能力和高重復(fù)性，鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下有益技術(shù)效果：

13、（1）本發(fā)明提供的indel分子標(biāo)記oa-indel-133具備高度的特異性和穩(wěn)定性，能夠基于基因組水平的插入缺失差異，實(shí)現(xiàn)皮燕麥與裸燕麥的精準(zhǔn)區(qū)分，克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對生育期、環(huán)境條件依賴強(qiáng)、準(zhǔn)確性差等問題，顯著提升了種質(zhì)資源的鑒定效率與準(zhǔn)確性；

14、（2）本發(fā)明提供的indel分子標(biāo)記oa-indel-133具有高度的特異性和良好的重復(fù)性，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定可靠，不受樣品組織類型、生育時期及環(huán)境條件的影響，適用于種質(zhì)資源分類、品種身份鑒定、種子純度檢測、育種材料溯源等多種應(yīng)用場景，具有重要的推廣應(yīng)用價值和產(chǎn)業(yè)化前景；

15、（3）本發(fā)明提供的引物對及其配套pcr體系和降落擴(kuò)增程序，具有良好的擴(kuò)增穩(wěn)定性和適用性，不受樣本組織類型及栽培條件限制，可在不同實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)獲得一致的擴(kuò)增結(jié)果，適用于種子純度檢測、種質(zhì)資源管理、雜交育種篩選、植物新品種權(quán)屬保護(hù)等多種應(yīng)用場景，具有廣泛的實(shí)用推廣價值。