本發(fā)明屬于蛋白酶提取領域，具體是指一種高效提取菠蘿蛋白酶的方法。

背景技術：

1、菠蘿蛋白酶是從菠蘿的果實、莖、葉等部位提取的一種蛋白水解酶，它是一種混合蛋白酶，主要由多種巰基蛋白酶組成，具有較廣的底物特異性，能夠分解多種蛋白質(zhì)，產(chǎn)生多肽和氨基酸，菠蘿蛋白酶的提取為菠蘿加工產(chǎn)業(yè)帶來了附加值，以往菠蘿加工過程中產(chǎn)生的菠蘿皮、菠蘿芯等廢棄物中含有豐富的菠蘿蛋白酶，通過提取可以變廢為寶，降低企業(yè)成本，增加經(jīng)濟效益。

2、菠蘿蛋白酶在醫(yī)藥領域具有重要價值，具有抗炎、消腫、止痛等多種藥理作用，可用于治療關節(jié)炎、肌肉疼痛、骨折等疾病，此外，它還具有一定的抗凝血、抗腫瘤等潛在作用，為開發(fā)新型藥物提供了資源。在食品工業(yè)中，菠蘿蛋白酶可以作為肉類嫩化劑，使肉類在烹飪過程中更易變嫩，改善口感，同時，它也可以用于食品保鮮，通過分解蛋白質(zhì)來抑制微生物的生長，延長食品的保質(zhì)期。

3、目前，現(xiàn)有菠蘿蛋白酶提取技術存在以下問題：第一、現(xiàn)有菠蘿蛋白酶提取技術需要使用大量的硫酸銨，所提取的菠蘿蛋白酶酶活力較低；第二、現(xiàn)有菠蘿蛋白酶提取技術所制備的菠蘿蛋白酶溶解度差，生產(chǎn)出的菠蘿蛋白酶色澤深，穩(wěn)定性差；第三、現(xiàn)有菠蘿蛋白酶提取技術所提取的菠蘿蛋白酶雜質(zhì)含量多，產(chǎn)品純度低。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供了一種高效提取菠蘿蛋白酶的方法，為了解決現(xiàn)有菠蘿蛋白酶提取所提取的菠蘿蛋白酶酶活力較低，色澤深，穩(wěn)定性差，雜質(zhì)含量多，產(chǎn)品純度低的問題，本發(fā)明提出將新鮮菠蘿果肉粉碎速凍后，混合活性保持劑、復合酶進行預處理后，使用高效吸附沉淀劑進行菠蘿蛋白酶的沉淀，可以達到所提取菠蘿蛋白酶酶活力高，純度高，穩(wěn)定性強，感官特征優(yōu)良的效果。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下，本發(fā)明提出了一種高效提取菠蘿蛋白酶的方法，具體包括如下步驟：

3、步驟一、將重量份為200-300份新鮮菠蘿果肉放入功率為1.5-1.8?kw的粉碎機中，粉碎溫度為23-28℃，粉碎時長為25-30?min，粉碎轉(zhuǎn)速為3500-4500?r/min，粉碎后放入功率為2?kw的液氮速凍機中，速凍溫度為-80℃，速凍時長為7-10?min，得到速凍后菠蘿碎；

4、步驟二、將步驟一所制速凍后菠蘿碎與重量份為8-11份的活性保持劑放入功率為1.8?kw的攪拌罐中，攪拌溫度為4℃，攪拌時長為10-15?min，攪拌轉(zhuǎn)速為15?r/min，混合后，加入2.8-3.4份復合酶、醋酸-醋酸鈉緩沖液，繼續(xù)攪拌20?min，放置3?h酶解后，放入功率為1.8-2.4?kw的磨漿機中，磨漿溫度為4℃，磨漿時長為20-25?min，磨漿轉(zhuǎn)速為18000-20000r/min，進行磨漿后，得到預處理后菠蘿漿液；

5、步驟三、將步驟二所制預處理后菠蘿漿液放入功率為3.8?kw的高速離心機中，離心溫度為2℃，離心轉(zhuǎn)速為8000-12000?r/min，離心時長為15?min，進行離心后，取上清液，得到含菠蘿蛋白酶混合液；

6、步驟四、將步驟三所制含菠蘿蛋白酶混合液與重量份為9-12份高效吸附沉淀劑，放入功率為2.2?kw的恒溫攪拌罐中，恒溫攪拌溫度為4℃，恒溫攪拌時長為3?h，恒溫攪拌轉(zhuǎn)速為300-500?r/min，得到含菠蘿蛋白酶沉淀；

7、步驟五、將步驟四所制含菠蘿蛋白酶沉淀、檸檬酸緩沖液放入功率為1.8?kw的攪拌器中，攪拌溫度為15℃，攪拌時長為30?min，攪拌轉(zhuǎn)速為100-200?r/min，混勻洗脫，放入功率為3.8?kw的高速離心機中，離心溫度為2℃，離心轉(zhuǎn)速為8000-12000?r/min，離心時長為15?min，進行離心后，取上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液；

8、步驟六、將步驟五所制菠蘿蛋白酶溶液，放入超濾膜系統(tǒng)中，超濾膜孔徑的截留分子量為10?kda-20?kda，超濾溫度為0-10℃，進行超濾濃縮后，放入功率為2.3-2.8?kw的真空冷凍納米噴霧干燥機中，真空度為-0.05?mpa，冷凍納米噴霧干燥溫度為-40℃，冷凍納米噴霧干燥粒徑為100?nm，冷凍納米噴霧干燥時長為2.5-3?h，進行冷凍噴霧干燥，得到菠蘿蛋白酶凍干粉，儲存于-20℃條件下。

9、優(yōu)選地，在步驟二中，所述復合酶由纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶組成，重量份混合比為1.2：1.3：1，所述復合酶在醋酸-醋酸鈉緩沖液中的質(zhì)量分數(shù)為15%，所述醋酸-醋酸鈉緩沖液ph為4.5。

10、優(yōu)選地，在步驟五中，所述菠蘿蛋白酶沉淀與檸檬酸緩沖液的料液比為1：25?g/ml，所述檸檬酸緩沖液的ph為6.0。

11、優(yōu)選地，在步驟二中，所述活性保持劑的制備原料，包含以下重量份的組分：

12、海藻糖3-4份、抗壞血酸磷酸酯鎂2.2-2.6份、多聚磷酸鈉1.5-1.8份、硫代乙酸糠酯1.3-1.5份、聚天冬氨酸1.8-2.1份、亞精胺0.6-0.9份；

13、所述活性保持劑的制備方法，具體包括如下步驟：

14、s1、將海藻糖、抗壞血酸磷酸酯鎂、多聚磷酸鈉、超純水，放入功率為2.4?kw的反應釜中，反應溫度為90℃，反應速度為500-800?r/min，反應時長為24?h，混合進行反應，得到保持活性復合物；

15、s2、硫代乙酸糠酯、聚天冬氨酸、亞精胺、無水乙醇、二甲基亞砜，放入功率為2.4kw的反應釜中，反應溫度為55℃，反應速度為500?r/min，反應時長為24?h，得到具有網(wǎng)狀結構的抗菌維穩(wěn)混合物；

16、s3、將s2所制抗菌維穩(wěn)混合物與s1所制保持活性復合物，放入功率為1.8?kw的攪拌器中，攪拌溫度為15℃，攪拌時長為30?min，攪拌轉(zhuǎn)速為100-200?r/min，混合充分吸附，放入功率為2.3-2.8?kw的凍干機中，凍干溫度為-40℃，凍干時長為4?h，進行凍干，得到活性保持劑。

17、進一步地，在s1中，所述海藻糖在超純水中的質(zhì)量分數(shù)為12%。

18、進一步地，在s2中，所述硫代乙酸糠酯在無水乙醇中的質(zhì)量分數(shù)為3%，所述聚天冬氨酸在二甲基亞砜中的質(zhì)量分數(shù)為8%。

19、優(yōu)選地，在步驟四中，所述高效吸附沉淀劑的制備原料，包含以下重量份的組分：

20、原花青素2.2-2.6份、十二烷基硫酸鈉1.2-1.4份、氯化鋅1.3-1.6份、硫酸鎂2.4-2.8份、甲基纖維素1.5-1.8份、檸檬酸1.1-1.3份；

21、所述高效吸附沉淀劑的制備方法，具體包括如下步驟：

22、l1、將原花青素、十二烷基硫酸鈉、氯化鋅，放入功率為1.8?kw的攪拌罐中，攪拌溫度為25℃，攪拌時長為10-15?min，攪拌轉(zhuǎn)速為500?r/min，混勻后，得到吸附蛋白酶組合物；

23、l2、將硫酸鎂、甲基纖維素、檸檬酸、超純水，放入功率為2.2?kw的恒溫攪拌罐中，恒溫攪拌溫度為50-60℃，恒溫攪拌時長為3?h，恒溫攪拌轉(zhuǎn)速為50-150?r/min，進行混合反應，得到輔助吸附混懸液；

24、l3、將l1所制吸附蛋白酶組合物加入到l2所制輔助吸附混懸液中，攪拌溫度為25℃，攪拌時長為15-20?min，攪拌轉(zhuǎn)速為300?r/min，混勻后，放入功率為2.3-2.8?kw的真空冷凍納米噴霧干燥機中，真空度為-0.05?mpa，冷凍納米噴霧干燥溫度為-40℃，冷凍納米噴霧干燥粒徑為100?nm，冷凍納米噴霧干燥時長為2.5-3?h，進行冷凍噴霧干燥，得到高效吸附沉淀劑。

25、進一步地，在l2中，所述硫酸鎂在超純水中的質(zhì)量分數(shù)為10%。

26、本發(fā)明取得的有益效果包括：

27、本發(fā)明采用新鮮菠蘿果肉先粉碎后，再進行速凍，可以更有效地破壞細胞結構，使蛋白酶從細胞內(nèi)釋放出來，避免了先速凍導致菠蘿細胞中的蛋白酶不能充分釋放，更有效保護了所含菠蘿蛋白酶的活性，速凍后菠蘿碎中加入活性保持劑，海藻糖、抗壞血酸磷酸酯鎂、多聚磷酸鈉，混合后，海藻糖的羥基可以與抗壞血酸磷酸酯鎂中的磷酸酯基團或羥基、以及多聚磷酸鈉中的磷酸根離子形成氫鍵，結合形成的保持活性復合物可以抑制自由基的生成，在應激條件下可以與菠蘿蛋白酶相互作用，形成穩(wěn)定的水合層，從而保護菠蘿蛋白酶的三維結構，通過與金屬離子的螯合作用，減少金屬離子對酶活性的干擾，防止酶分子之間的聚集，保護菠蘿蛋白酶免受溫度、ph值變化和其他化學物質(zhì)的影響，從而高效維持其活性，硫代乙酸糠酯、聚天冬氨酸、亞精胺，混合反應，硫代乙酸糠酯是一種疏水性化合物，其疏水部分可以嵌入聚天冬氨酸和亞精胺形成的網(wǎng)絡結構中，硫代乙酸糠酯中的硫代乙酸酯基團還可以與聚天冬氨酸中的羧基或亞精胺中的氨基發(fā)生酯化或酰胺化反應，形成共價鍵，進一步增強產(chǎn)物的穩(wěn)定性和網(wǎng)狀結構的完整性，得到的抗菌維穩(wěn)混合物可以通過干擾微生物的代謝過程，并作為一種物理屏障，阻止微生物的穿透和擴散起到抗菌防腐的效果，可以包裹和固定菠蘿蛋白酶，與菠蘿蛋白酶的疏水區(qū)域相互作用，形成穩(wěn)定的微環(huán)境，抗菌維穩(wěn)混合物充分吸附保持活性復合物，進行凍干，得到的活性保持劑有效維持菠蘿蛋白酶的活性與結構穩(wěn)定性；含有纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶的復合酶溶于醋酸-醋酸鈉緩沖液中，進行酶解菠蘿果肉，確保酶解過程中菠蘿蛋白酶的活性不受影響，增加了菠蘿蛋白酶的可溶性，還減少了酶在細胞內(nèi)的滯留；原花青素、十二烷基硫酸鈉、氯化鋅，混合得到的吸附蛋白酶組合物可以與菠蘿蛋白酶表面的正電荷基團發(fā)生靜電相互作用、疏水作用，進行有效地吸附菠蘿蛋白酶，導致其溶解度降低，從而沉淀，硫酸鎂、甲基纖維素、檸檬酸、超純水，混合反應，甲基纖維素分子鏈之間可以通過氫鍵和范德華力相互作用，硫酸鎂在溶液中解離的離子可以與甲基纖維素分子鏈上的羥基發(fā)生離子-偶極相互作用，增強分子鏈之間的交聯(lián)程度，檸檬酸分子中含有多個羧基，可以與甲基纖維素分子鏈上的羥基發(fā)生酯化反應，得到的輔助吸附混懸液干燥后可以形成薄膜，輔助吸附混懸液能夠與菠蘿蛋白酶表面的負電荷基團發(fā)生靜電相互作用，從而屏蔽菠蘿蛋白酶分子表面的負電荷，減弱分子之間的靜電斥力，干擾蛋白酶分子表面的水化層，使得菠蘿蛋白酶分子更容易相互接觸，同時，靜電斥力的減弱使得蛋白酶分子之間的相互作用增強，從而更容易聚集并沉淀，吸附蛋白酶組合物加入到輔助吸附混懸液中，進行冷凍噴霧干燥，得到的高效吸附沉淀劑可以使所提取的菠蘿蛋白酶更高效地被吸附沉淀；使用檸檬酸緩沖液進行洗脫含菠蘿蛋白酶沉淀后，進行超濾，冷凍噴霧干燥，得到的菠蘿蛋白酶凍干粉酶活高，純度高，穩(wěn)定性強。