本發(fā)明屬于基因表達，具體涉及一種基于紅光介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、基因表達調(diào)控是指細胞或生物體在接收到內(nèi)外環(huán)境信號刺激時，通過一系列的反應(yīng)將信號傳遞到細胞內(nèi)部，并對相關(guān)基因的表達水平進行調(diào)整的過程。轉(zhuǎn)錄激活是其中轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的一種，轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合到靶基因的調(diào)控區(qū)域后，促進rna聚合酶與啟動子結(jié)合后轉(zhuǎn)錄起始?；蜣D(zhuǎn)錄需要受到精確調(diào)控，持續(xù)的基因表達可能干擾細胞的正常活動。例如，erf14是一個擬南芥的乙烯相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其組成型過量表達雖能提高植物耐熱性和抗病性，但也會導(dǎo)致植株發(fā)育矮小，且下游pdf1.2基因的表達水平顯著上升。因此，對基因轉(zhuǎn)錄的精確調(diào)控具有重要意義。
2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具一般可分為組成型和誘導(dǎo)型，目的基因的組成型表達往往會造成資源的不必要浪費，同時大量蛋白的積累也會影響植物本身的代謝平衡以及正常生長發(fā)育過程，而誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具不會造成浪費和蛋白積累。誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具可以快速有效地誘導(dǎo)基因的表達，還可按照需求在植物特定發(fā)育階段、組織器官或生長環(huán)境下接受誘導(dǎo)信號，從而調(diào)控基因表達。但常規(guī)的如高溫、干旱誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活可能影響植物正常生長，而化學(xué)成分誘導(dǎo)可能對植物產(chǎn)生侵害性和脫敏性。
3、因此，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)型的新轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式，具備無侵害性、無副作用等優(yōu)點，從而有效調(diào)控植物的基因表達。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題之一。為此，本發(fā)明提出一種基于紅光介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及其應(yīng)用。利用光介導(dǎo)的方法調(diào)控植物蛋白棕櫚?；?，具有無侵害性、無副作用等優(yōu)點。通過棕櫚酰化修飾將轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子限制在質(zhì)膜上進行按需釋放，實現(xiàn)快速、可逆、精準的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此，該發(fā)明可廣泛應(yīng)用于植物的發(fā)育、抗逆和代謝調(diào)控，以提高作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。
2、本發(fā)明提供了一種基于紅光介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括ncbl1-熒光蛋白1-轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-fhy1與apt8-熒光蛋白2-δphya；
3、所述熒光蛋白1和所述熒光蛋白2選自不同種類。
4、已知棕櫚?；揎検且环N可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，棕櫚酸通過蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，底物蛋白通過棕櫚?；^定在膜上，從而調(diào)控底物蛋白的定位、穩(wěn)定性和活性等。去棕櫚?；福ㄍǔ轷；鞍踪|(zhì)硫酯酶）則通過水解棕櫚酰基團和底物蛋白之間的硫酯鍵以移除棕櫚?；鶑亩淖兊孜锏鞍椎亩ㄎ?。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄因子是一類結(jié)合到dna上并調(diào)節(jié)基因表達的蛋白。因此，通過改變轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位來實現(xiàn)基因表達的精確調(diào)控是一個可行的策略。
5、cbl1是一種鈣結(jié)合蛋白，有研究報道其n端12個氨基酸殘基（ncbl1）作為棕櫚?；揎椈?，可通過棕櫚酰化修飾將蛋白定位在質(zhì)膜上，而光敏蛋白可以感知并響應(yīng)光信號。本發(fā)明技術(shù)方案中fhy1和phya是典型響應(yīng)紅光/遠紅光信號的光敏色素。紅光可誘導(dǎo)δphya（phya的n端617個氨基酸殘基）由紅光吸收型pr態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫h紅光吸收型pfr態(tài)后與fhy1形成互作模塊進入細胞核中。因此，δphya和fhy1可以作為紅光誘導(dǎo)的二聚化蛋白模塊。
6、前期研究表明apt8是一個蛋白質(zhì)去棕櫚酰化酶，其過表達并不影響植物的正常發(fā)育，而且該酶在天然狀態(tài)下并不影響ncbl1的棕櫚?；?。因此，通過將轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與ncbl1（以熒光蛋白1作為標志）及fhy1融合，通過ncbl1的棕櫚?；瘜⑵涠ㄎ挥诩毎|(zhì)膜；同時將apt8（以熒光蛋白2作為標志）與δphya融合；當施加紅光時，fhy1與δphya相互作用，從而促進apt8對ncbl1的去棕櫚?；?，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子從質(zhì)膜上脫離而進入細胞核調(diào)控下游基因表達。
7、在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和fhy1融合在熒光蛋白1的c端，通過融合ncbl1從而錨定在質(zhì)膜中，熒光蛋白1用于監(jiān)測該融合蛋白的亞細胞定位。apt8和δphya分別融合在熒光蛋白2的n端和c端，熒光蛋白2用來監(jiān)測該融合蛋白的亞細胞定位。在黑暗和白光下轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被限制在質(zhì)膜上，從而限制其功能，而紅光誘導(dǎo)使轉(zhuǎn)錄元件在調(diào)控元件作用下通過去棕櫚?；瘡馁|(zhì)膜上轉(zhuǎn)移至細胞核，進而通過轉(zhuǎn)錄元件中的轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該方法利用安全無害、精確可控的光遺傳學(xué)的方式操縱可逆棕櫚?；揎棌亩鴮崿F(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
8、優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
9、優(yōu)選地，所述熒光蛋白1及所述熒光蛋白2選自綠色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
10、本發(fā)明還提供了上述基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在植物育種中的應(yīng)用。
11、本發(fā)明還提供了上述基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在提高植物產(chǎn)量、品質(zhì)或抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于植物的發(fā)育、抗逆和代謝調(diào)控，以提高作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。
12、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：
13、（1）本發(fā)明通過無侵害性的紅光實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而避免了其對植物發(fā)育的影響，同時也有清晰的作用機制，是一種安全可靠的基因轉(zhuǎn)錄激活方式。
14、（2）本發(fā)明使用紅光誘導(dǎo)，不需要添加其他化學(xué)成分進行誘導(dǎo)，同時利用紅光誘導(dǎo)基因表達所需的時間極短，而且可利用遠紅光解除該激活作用，實現(xiàn)快速和可逆的基因表達調(diào)控。因此本發(fā)明可用于精準快速的植物基因表達調(diào)控，且不受節(jié)律變化的影響。
15、（3）由于去棕櫚酰化和光誘導(dǎo)二聚化機制具有物種保守性，因此本發(fā)明可以應(yīng)用到不同的植物中，具有廣泛的用途。
1.一種基于紅光介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于，包括ncbl1-熒光蛋白1-轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-fhy1與apt8-熒光蛋白2-δphya；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其特征在于，所述熒光蛋白1及所述熒光蛋白2選自綠色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在植物育種中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3中任一項所述的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在提高植物產(chǎn)量、品質(zhì)或抗逆性中的應(yīng)用。