背景技術(shù)：
1、隨著更強大且負(fù)擔(dān)得起的測序技術(shù)的出現(xiàn)，靶向測序變得越來越重要。大多數(shù)用于分析目標(biāo)核酸序列的傳統(tǒng)方法涉及靶向雜交和捕獲(gnirke等人，2009年)、多重pcr(campbell等人，2015年)或分子倒置探針(shen等人，2011年)。這些方法要么昂貴、難以優(yōu)化、數(shù)據(jù)變異性大，要么缺乏靈活性，無法對不同長度的目標(biāo)進(jìn)行測序。因此，需要改進(jìn)的方法用于分析(如檢測和測序)目標(biāo)核酸序列。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本文公開的某些實施方式提供了用于擴增目標(biāo)核酸序列和/或基因組區(qū)域以及可選地例如通過檢測和/或測序進(jìn)一步分析目標(biāo)序列的材料和方法。
2、在某些實施方式中，本文公開的擴增目標(biāo)序列的方法包括將第一目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和dna聚合酶結(jié)合，其中目標(biāo)特異性寡核苷酸引物包括至少10個與感興趣的核酸序列互補的核苷酸和與感興趣的序列不互補的第一接頭序列(在示例中也可被稱為“讀數(shù)1”序列)。第一接頭序列可選地包含限制性酶識別位點。然后，第一目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和目標(biāo)序列可被dna聚合酶擴增，從而線性擴增目標(biāo)核酸序列。在某些實施方式中，擴增反應(yīng)的產(chǎn)物可以用特異于第一接頭序列中的限制性酶識別位點的限制性酶進(jìn)行消化，從而消除引物二聚體。
3、在某些實施方式中，擴增反應(yīng)或限制性酶消化的產(chǎn)物可以通過加入第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和dna聚合酶來稀釋，其中第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物包括具有至少10個堿基的部分，這些堿基與擴增的感興趣的核酸序列互補，還包括與感興趣的序列不互補的第二接頭序列(在示例中也可稱為“讀數(shù)2”序列)。
4、然后，第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和擴增的目標(biāo)序列可被dna聚合酶和第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物擴增，從而提供與擴增的目標(biāo)序列互補的核酸序列。
5、在某些實施方式中，擴增的目標(biāo)序列核酸和與擴增的目標(biāo)序列互補的序列可與退火為第一接頭序列的補體的第一標(biāo)簽寡核苷酸引物(例如，第一索引引物)和退火為第二接頭序列的補體的第二標(biāo)簽寡核苷酸引物(例如，第二索引引物)結(jié)合，以擴增感興趣的核酸序列，擴增后形成感興趣的標(biāo)簽序列文庫。
6、在某些實施方式中，感興趣的標(biāo)簽序列文庫適合進(jìn)一步檢測和/或測序。測序可采用下一代測序技術(shù)(如納米孔測序、可逆染料終止子測序、單分子實時(smrt)測序或雙端測序)進(jìn)行。
7、在某些實施方式中，使用多個第一目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和(在隨后的擴增反應(yīng)中)多個第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物以及多個第一和第二標(biāo)簽引物捕獲樣本中的多個目標(biāo)序列，擴增退火至相應(yīng)目標(biāo)序列(或其補體)的第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物以捕獲多個目標(biāo)序列。寡核苷酸引物可進(jìn)一步用于產(chǎn)生適合進(jìn)一步檢測和測序的目標(biāo)序列的雙鏈拷貝。在多重測序反應(yīng)中，多個第一和第二標(biāo)簽引物可與多個擴增的目標(biāo)核酸樣本結(jié)合以進(jìn)行測序。第一和第二標(biāo)簽引物可包括獨特的識別序列，用于識別擴增的目標(biāo)序列的來源。測序步驟之后，樣本特異性唯一標(biāo)識符用于為樣本和捕獲的目標(biāo)序列的序列分配序列。測序可采用下一代測序技術(shù)(如納米孔測序、可逆染料終止子測序、單分子實時(smrt)測序或雙端測序)進(jìn)行。
8、本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式提供了用于實施本文所公開方法的試劑盒。所述試劑盒包括一種或多種：一對或多對目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和一對或多對標(biāo)簽引物、酶(如dna聚合酶)、測序試劑和用于進(jìn)行試驗的說明書。
1.一種擴增目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一接頭序列包括限制性酶的識別位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括用限制性酶處理步驟b)的產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一目標(biāo)結(jié)合序列包括與所述目標(biāo)核酸序列互補的至少10個堿基。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其中所述目標(biāo)核酸序列在約10bp至約100bp之間、約100bp至約300bp之間或約300bp至約500bp之間。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法，其中所述第一或第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物每個包含約20至約60個核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第一目標(biāo)結(jié)合序列在約10至約30個核苷酸之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二目標(biāo)結(jié)合序列在約10至約30個核苷酸之間。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法，包括使用dna聚合酶在聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)中擴增所述目標(biāo)核酸序列或其互補序列，以產(chǎn)生單鏈形式的目標(biāo)序列拷貝。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括對標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)序列的文庫進(jìn)行測序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述測序包括納米孔測序、可逆染料終止子測序、單分子實時(smrt)測序或雙端測序。
12.一種用于捕獲多個目標(biāo)核酸序列的方法，包括以下步驟：
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一接頭序列包括限制性酶的識別位點。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，進(jìn)一步包括用限制性酶處理步驟b)的產(chǎn)物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中每個第一目標(biāo)結(jié)合序列包括與每個目標(biāo)核酸序列互補的至少10個堿基。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15任一項所述的方法，其中每個目標(biāo)核酸序列在約10bp至約100bp之間，約100bp至約300bp之間，或約300bp至約500bp之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16任一項所述的方法，其中所述第一或第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物每個包含約20至約60個核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中每個第一目標(biāo)結(jié)合序列在約10至30個核苷酸之間。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中每個第二目標(biāo)結(jié)合序列在約10至約30個核苷酸之間。
20.根據(jù)權(quán)利要求12至19任一項所述的方法，包括使用dna聚合酶在聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)中擴增多個目標(biāo)核酸序列或其互補序列，以產(chǎn)生單鏈形式的目標(biāo)序列的拷貝。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括測序標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)序列的文庫。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述測序包括納米孔測序、可逆染料終止子測序、單分子實時(smrt)測序或雙端測序。
23.一種包含一對或多對引物的試劑盒，每對引物包括第一目標(biāo)特異性寡核苷酸引物和第二目標(biāo)特異性寡核苷酸引物，其中：
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，進(jìn)一步包括一個或多個標(biāo)簽引物對，每個標(biāo)簽引物對包括退火為第一接頭序列的補體的第一標(biāo)簽引物和退火為第二接頭序列的補體的第二標(biāo)簽引物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的試劑盒，進(jìn)一步包括以下中的一種或多種：dna聚合酶、pcr試劑、dna測序試劑、設(shè)計用于處理測序數(shù)據(jù)的計算機軟件程序和使用試劑盒的說明。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的試劑盒，其中所述第一目標(biāo)特異性寡核苷酸引物、所述第二目標(biāo)特異性寡核苷酸、一個或多個標(biāo)簽引物對、dna聚合酶、pcr試劑、dna測序試劑被干燥或凍干，可選地干燥到凍干到微孔板的單個孔中。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的方法，其中在目標(biāo)核酸序列或多個第一和/或第二目標(biāo)序列中的是/是從rna序列逆轉(zhuǎn)錄的cdna序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至22或27任一項所述的方法，其中在步驟b)或d)中的擴增之后不執(zhí)行純化步驟。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至22或27至28中任一項所述的方法，其中重復(fù)步驟a)和b)中的退火和擴增目標(biāo)序列的步驟。