本發(fā)明屬于生物，具體涉及豬流行性腹瀉病毒微流控?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬流行性腹瀉（ped）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrheavirus,?pedv）引起的高度接觸性腸道傳染病，患病仔豬死亡率高達(dá)100%。

2、傳統(tǒng)檢測(cè)方法依賴rt-pcr技術(shù)，但以下方面存在局限性：例如操作繁瑣，需手動(dòng)完成核酸提取、擴(kuò)增等步驟，易污染且耗時(shí)；靈敏度不足，難以檢測(cè)低濃度病毒樣本（如＜10^3拷貝/ml）；現(xiàn)有外源性內(nèi)標(biāo)序列的設(shè)計(jì)常因與病原擴(kuò)增條件不兼容（如引物競(jìng)爭(zhēng)、擴(kuò)增效率失衡）導(dǎo)致假陰性判讀或靈敏度下降；引物覆蓋性差，現(xiàn)有引物設(shè)計(jì)未能覆蓋pedv基因突變區(qū)域，導(dǎo)致漏檢等。改善前述任意一個(gè)方面，都有望于改善pedv檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

3、因此，對(duì)于豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)，需要提供一種流程自動(dòng)化、假陰性率低、可以應(yīng)對(duì)病毒基因突變的高靈敏度檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種基于微流控卡槽式芯片技術(shù)整合核酸提取與熒光rt-pcr的豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)試劑盒，及其在動(dòng)物疫病快速診斷中的應(yīng)用。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒（pedv）的一體化卡盒，所述卡盒包含：

3、針對(duì)pedv?n基因的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no:1、seq?id?no:2和seqid?no:4所示，所述探針如seq?id?no:3所示；

4、針對(duì)pedv?orf1基因的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no:5、seq?id?no:6和seq?id?no:8所示，所述探針如seq?id?no:7所示；和/或

5、針對(duì)pedv?m基因的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no:9、seq?id?no:10和seq?id?no:11所示，所述探針如seq?id?no:12所示。

6、在另一優(yōu)選例中，所述探針的5'端用fam修飾。

7、在另一優(yōu)選例中，所述一體化卡盒還包括擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的引物和探針，所述外源性內(nèi)標(biāo)序列如seq?id?no:31所示。

8、在另一優(yōu)選例中，所述擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的引物和探針中，所述探針的5'端用rox修飾。

9、在另一優(yōu)選例中，所述一體化卡盒自上而下設(shè)置四個(gè)分離腔體的小室，其中第一個(gè)小室內(nèi)包含裂解提取液，所述裂解提取液用于樣本的裂解與核酸的提??；第二個(gè)小室內(nèi)包含樣本洗滌液i，所述樣本洗滌液i用于核酸的第一次洗滌；第三個(gè)小室內(nèi)包含樣本洗滌液ii，所述樣本洗滌液ii用于核酸的第二次洗滌；第四個(gè)小室內(nèi)包含反應(yīng)液，所述反應(yīng)液包含所述引物對(duì)和探針。

10、在另一優(yōu)選例中，所述裂解提取液包含裂解液和磁珠。

11、在另一優(yōu)選例中，所述裂解液包含異硫氰酸胍486.59g/l，triton?x-100?60ml/l，乙酸2ml/l。

12、在另一優(yōu)選例中，所述磁珠是硅羥基磁珠。

13、在另一優(yōu)選例中，所述硅羥基磁珠吸附pedv的病原基因組rna/dna、內(nèi)標(biāo)基因和/或物種基因定向移動(dòng)。

14、在另一優(yōu)選例中，所述樣本洗滌液i包含三羥甲基氨基甲烷15.138g/l，聚乙二醇100g/l。

15、在另一優(yōu)選例中，所述樣本洗滌液ii包含三羥甲基氨基甲烷6.055g/l，氯化鉀15g/l，無(wú)水乙醇300ml/l。

16、在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)液中，包含mn2+?50mm，所述引物對(duì)各40μm，所述探針40μm。

17、在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)液還包含擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的引物和探針，所述外源性內(nèi)標(biāo)序列如seq?id?no:31所示。

18、在另一優(yōu)選例中，所述擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的引物如seq?id?no:32和seq?id?no:33所示，所述探針如seq?id?no:34所示。

19、在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)液中，包含所述擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的引物40μm，擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的探針40μm。

20、在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的卡盒的用途，用于制備試劑盒，所述試劑盒用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒（pedv）。

21、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)pedv的試劑，所述試劑包括：

22、針對(duì)pedv?n基因的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no:1、seq?id?no:2和seqid?no:4所示，所述探針如seq?id?no:3所示；

23、針對(duì)pedv?orf1基因的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no:5、seq?id?no:6和seq?id?no:8所示，所述探針如seq?id?no:7所示；和/或

24、針對(duì)pedv?m基因的引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)如seq?id?no:9、seq?id?no:10和seq?id?no:11所示，所述探針如seq?id?no:12所示。

25、在另一優(yōu)選例中，所述試劑中還包含擴(kuò)增外源性內(nèi)標(biāo)序列的引物和探針，所述外源性內(nèi)標(biāo)序列如seq?id?no:31所示。

26、在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第三方面所述的試劑的用途，用于制備試劑盒或一體化卡盒裝置，所述試劑盒或一體化卡盒裝置用于檢測(cè)樣本中的pedv。

27、在另一優(yōu)選例中，所述樣本是來(lái)自于豬的樣本。

28、在另一優(yōu)選例中，所述樣本包含：血液樣本、尿液樣本、或者糞便樣本。

29、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種檢測(cè)pedv的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明第一方面所述的卡盒或本發(fā)明第三方面所述的試劑。

30、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)包含定性檢測(cè)和/或定量檢測(cè)。

31、在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包含說(shuō)明書，所述說(shuō)明書指導(dǎo)所述試劑盒用于檢測(cè)樣本中的pedv。

32、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測(cè)樣本中pedv的方法，包括以下步驟：

33、（s1）提供待測(cè)樣本；

34、（s2）將待測(cè)樣本加入本發(fā)明第一方面所述的卡盒，從而檢測(cè)樣本中pedv。

35、在另一優(yōu)選例中，所述樣本是來(lái)自于豬的樣本。

36、在另一優(yōu)選例中，所述樣本包含：血液樣本、尿液樣本、或者糞便樣本。

37、在另一優(yōu)選例中，所述待測(cè)樣本的加入量為300-1000μl，較佳地為400-800μl，最佳地為600μl。

38、在另一優(yōu)選例中，所述方法是非診斷非治療目的的方法。

39、在另一優(yōu)選例中，所述方法是科研目的的方法。

40、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)包含定性檢測(cè)和/或定量檢測(cè)。

41、在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測(cè)樣本中pedv的裝置，包括以下模塊：

42、（z1）樣本提供模塊，所述樣本提供模塊被配置為：提供待測(cè)樣本；

43、（z2）檢測(cè)模塊，所述檢測(cè)模塊被配置為：將待測(cè)樣本加入本發(fā)明第一方面所述的卡盒中，從而檢測(cè)樣本中的pedv。

44、在另一優(yōu)選例中，所述裝置還包含：（z3）結(jié)果輸出模塊，所述結(jié)果輸出模塊被配置為：記錄所述卡盒中顯示的熒光信號(hào)，從而輸出所述樣本中pedv的檢測(cè)結(jié)果。

45、本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

46、（a）本發(fā)明提供了三組覆蓋幾乎所有pedv毒株、在基于微流控卡槽式芯片技術(shù)的卡盒中仍然具有高靈敏度的廣譜引物探針。

47、（b）本發(fā)明提供了一種全封閉自動(dòng)化檢測(cè)和鑒別pedv病原的卡盒，基于本發(fā)明提供的引物探針組，合適的外源性內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)、基于微流控卡槽式芯片技術(shù)的卡盒，實(shí)現(xiàn)了pedv病原的高效、靈敏、特異性檢測(cè)。

48、（c）本發(fā)明提供的卡盒檢測(cè)靈敏度低至4.5×102拷貝/ml；對(duì)六種其它病原體均無(wú)交叉反應(yīng)；引入外源性內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，假陰性風(fēng)險(xiǎn)低；廣譜引物探針可以應(yīng)對(duì)pedv的基因突變。基于所述卡盒的pedv檢測(cè)方法簡(jiǎn)單高效，有效降低人工操作帶來(lái)的誤差。

49、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。